鼻咽癌组织中Gli—I表达与淋巴管新生及淋巴结转移的关系

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摘要：目的：探讨鼻咽癌组织中Gli-I蛋白表达与淋巴管新生及淋巴结转移的关系。方法：应用免疫组织化学技术检测69例鼻咽癌及15例正常鼻咽上皮组织Gli-I蛋白表达和淋巴管密度（LVD），分析Gli-l蛋白表达水平与鼻咽癌患者临床病理特征及LVD之间的关系。结果：Gli-l蛋白在鼻咽癌组织中的表达高于正常鼻咽上皮（P<0.01），并且Gli-I蛋白表达与肿瘤淋巴管密度（r=0.464，P<0.01）和淋巴结转移有关（P<0.05）。结论：Gli-l在鼻咽癌过度表达可能调控淋巴管新生和促进淋巴结转移。

关键词：Hedgehog信号通路；Gli-l；鼻咽癌；淋巴管新生；转移

中图分类号：R739.6

文献标志码：A

文章编号：1008-2409（2015）02-0000-06

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）初诊时大部分患者存在颈部淋巴结转移。鼻咽癌组织中淋巴管过度新生与肿瘤侵袭淋巴管和淋巴结转移密切相关。业已证实，Hedgehog（Hh）信号通路不仅作为重要的经典信号途径参与胚胎发育、器官形成和干细胞维持的调控，也在某些成年组织中持续激活而导致祖细胞转化和恶性肿瘤发生。Gli-I是Hh信号通路的下游3个核转录因子（Gli-I、Gli-2和Gli3）之一，且只有激活核转录的功能，故Gli-I的表达水平可直接反映该信号通路的活性状态。Gli-I过度表达与多种恶性肿瘤淋巴结转移有关。并且，针对阻断Hh信号通路为靶点治疗基底细胞癌的临床研究取得成效。有学者观察到鼻咽癌组织中Hh信号通路分子异常表达。然而，Hh信号通路异常激活在鼻咽癌的病理和临床意义未见报道。深入研究Hh信号通路在鼻咽癌转移机制中的作用有助于寻找新的治疗靶点和预后评估指标。因此，本研究通过应用免疫组织化学技术观察鼻咽癌组织中Gli-I蛋白的表达，旨在分析Gli-I表达水平与患者临床病理特征的关系及对淋巴结管新生的调控作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

69例鼻咽癌组织标本为广西壮族自治区南溪山医院病理科存档石蜡包埋组织，系源自2013年4月至2014年4月该院肿瘤科收住院治疗的患者，由耳鼻喉科或肿瘤科医生行纤维鼻咽镜活组织检查取得的鼻咽肿物组织，经1O%福尔马林溶液同定和该院病理科确诊。病理类型均为非角化性未分化型鳞状细胞癌，有关临床及病理资料完整，均为初治患者；其中男56例，女13例；中位年龄52（32--74）岁。本组患者的临床分期（TNM）按照我国鼻咽癌福州2008分期标准进行分期：Ⅱ期8例，Ⅲ期22例，Ⅳa期33例，Ⅳb期6例；T分期如下：T1期4例，T2期21例，T3期23例，T4期21例；淋巴结受累状态：NO期11例，Nl期21例，N2期21例，N3期16例；远处转移情况：MO期63例，Ml期6例。对照组为15例同期于该院耳鼻咽喉科就诊，病理诊断为正常鼻咽黏膜上皮组织的存档蜡块包埋组织标本。本研究征得广西壮族自治区南溪山医院伦理委员会批准，并且经患者签署知情同意书。

1.2 试剂与方法

Gli-I兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司（Lot：ab134906），即用型D240鼠抗人单克隆抗体、HRP兔鼠通用型二抗及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。具体操作如下：蜡块包埋组织标本经5μm连续切片，73℃烤片15min，62℃烤片2h，脱蜡水化，置于pH6.0柠檬酸盐抗原修复夜加热煮沸修复20min；3%H202孵育10min；PBS冲洗3次，每次5min。擦干玻片，滴加Gli-l兔抗人单克隆抗体（工作浓度1：400）或D2-40鼠抗人单克隆抗体，37℃恒温箱2h，PBS冲洗3次，每次5min；擦干玻片分别滴加二抗，37℃恒温箱30min，PBS冲洗3次，每次5min；擦干玻片，以DAB溶液显色、苏木素复染，梯度乙醇脱水及干燥，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

1.3.1Gli-I表达的判定 Gli-I蛋白以胞质或胞核出现浅黄至深棕色颗粒为阳性。由2位病理科医生分别读片，结果不一致时由2位医生讨论后判定。随机选取5个高倍视野，分别计数200个细胞。阳性细胞率评分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分；按肿瘤细胞染色程度评分：0分为阴性，1分为浅黄色，2分为棕色和3分为深棕色；根据免疫反应评分体系（Immuno-Reactive-Score，IRS）对各标本中Gli-I蛋白表达情况进行评分，将两者相乘（阳性细胞率评分×细胞染色程度评分）得分≤6（即IRS：O～6分）为低表达，而得分≥7（即IRS：7～12分）为高表达。

1.3.2淋巴管密度的计算 D2-40免疫组织化学染色以细胞胞质或包膜染成黄色或棕黄色颗粒为阳性，淋巴管是D2-40染成阳性的单层扁平上皮且无红细胞聚集的脉管，淋巴管密度（LVD）的计算按照文献011中所采用的方法进行。

1.4 统计学分析

应用SPSS 18.O软件进行分析，各组间免疫反应评分均值比较应用t检验；各组间差异比较采用x-检验或Fisher"s Exact检验；计量资料之间相关性采用Spearman等级相关分析，以P

2 结果

2.1 鼻咽癌和正常鼻咽上皮中Gli-l蛋白的表达

本实验显示，Gli-l蛋白染色不同程度地见于正常鼻咽上皮细胞胞质、鼻咽癌细胞胞质和胞核，尤其鼻咽癌细胞核对Gli-1表达更为丰富（图1）。根据免疫反应评分体系对各标本中Gli-I蛋白表达情况进行评分，结果显示：69例鼻咽癌中Gli-I蛋白表达的综合评分为6.26±3.91，中位数为8（1--12），其中低表达（IRS：O～6分）占35例（50.7%），高表达（IRS：7～12分）占34例（49.3%）；15例正常鼻咽上皮中Gli-I的综合评分则为2.73±2.02，中位数为2（1～8），其中低表达占14例（93.3%），高表达为l例（6.7%）。癌组织中Gli-1蛋白的表达水平显著高于正常鼻咽上皮（P<0.01），详见表1。

2.2Gli-I蛋白表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系

按Gli-1蛋白低表达（lRS：0～6分）和高表达（IRS：7～12分）进行分层，将本组69例鼻咽癌对Gli-I表达水平与临床病理特征的关系进行分析，结果显示Gli-I表达水平与是否存在淋巴结转移的比较具有显著统计学意义（P<0.05），而与肿瘤侵袭程度、是否远处转移、临床分期、患者年龄及性别比较无统计学意义（表2）。

2.3 鼻咽癌中Gli-1蛋白表达与淋巴管新生的关系

本组鼻咽癌组织中LVD显著高于正常鼻咽上皮（P<0.05），提示癌组织存在淋巴管过度新生（表3）。应用Spearman统计分析，显示鼻咽癌组织中Gli-l蛋白表达的免疫染色评分与LVD呈显著正相关关系（r=0.464，P

3 讨论

Hh通路一旦激活，信号瀑布的产生使Gli-I蛋白迅速从胞质进入胞核与Cyclins（B、D、E、p21）、TGF-β家族、β-Catenin、MMPs及FGF家族等靶基因的特定序列结合，直接启动这些基冈表达，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、运动迁移及血管和淋巴管新生，导致肿瘤发生与进展。已有不少临床和病理证据提示Hh信号传导通路涉及恶性肿瘤的发生。目前对Hh信号通路与鼻咽癌发生及转移的关系仍缺乏研究。实验结果表明，肿瘤细胞可高表达某些促淋巴管生成因子，如VEGF-C/D和LYVE-l而诱导肿瘤组织淋巴管新生，淋巴管新生的活跃程度与肿瘤扩散至淋巴结直接有关。Hh信号通路成员分子（包括Shh、Gli-1）的表达可促进肿瘤细胞迁移、侵袭及淋巴道转移，影响上皮恶性肿瘤患者预后。本研究观察到鼻咽癌中Gli-l过度表达与肿瘤淋巴管新生及淋巴结转移有关。

本研究结果显示，鼻咽癌存在Gli-l过度表达，有淋巴结转移的鼻咽癌对Gli-I表达明显高于无淋巴结转移者，提示Hh信号途径过度激活涉及鼻咽癌发展。尚观察到正常鼻咽上皮细胞胞质普遍存在Gli-l蛋白染色阳性（呈低表达），除1例IRS评分为8分外。此可能与Gli-1在一定程度的表达对鼻咽上皮干细胞的维持、局部组织的修复和再生有关，与口腔及胃上皮对Gli-l表达的结果类似。据报道，EB病毒EBNAl、LMPl和LMP2A均可诱导感染El3病毒的细胞表达Shh配基，后者通过自分泌途径激活Hh通路而导致Gli-1过度表达。这反映EB病毒感染导致Hh信号通路的激活在鼻咽癌发病过程中也许发挥重要作用。有学者观察到Hh信号通路的分子表达与肺癌组织学类型有关，Gli-1主要表达在肺鳞癌。这种表达差异的原因和分子学意义未明确，可能与组织胚胎发生及肿瘤恶性生物学行为有关。由于本研究对象均为未分化型鳞状细胞癌，未对Gli-l表达水平与鼻咽癌细胞类型、分化程度作比较。因此，有必要扩大研究规模进行有关比较分析。

本研究提示Hh信号通路中Gli-1表达与鼻咽癌LVD密切相关（r=0.464，P

Hh信号通路分子过度表达诱导肿瘤细胞增殖和淋巴管新生是导致患者不良预后的重要因素。Hh信号通路的激活机制甚为复杂，干预该通路的自分泌及（或）旁分泌途径对癌细胞可能会产生不同效应。鉴于目前鼻咽癌易于转移及复发、对放化疗耐受难题仍未解决。因此，深入探讨Hh通路信号分子在鼻咽癌的表达及其具体作用机制、Hh抑制剂对鼻咽癌细胞和基质细胞的影响等，可望发现基于该通路而抑制肿瘤经淋巴管扩散的潜在治疗靶点。

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