材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品 待检测的金鱼来自沈阳、北京、郑州、武汉、昆明、福州、广州、湛江和海口等地花鸟鱼市场，鲫来自洪湖、洱海、巢湖、滇池和梁子湖等湖区，共采集了金鱼213尾，鲫196尾，每个采样点均为随机取样。
1.1.2 试验试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTPs购自Biostar公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司，pGEMT-Easy载体购自Promega公司，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，SYBR Premix Ex TaqⅡ购自TaKaRa公司，化学感受态细胞及抗生素购自北京全式金生物技术有限公司，其他试剂及耗材为国产或进口分装。
1.2 试验方法
1.2.1 TK基因克隆及标准质粒构建 试验鱼经MS222麻醉后，取脾和中肾组织经液氮速冻后保存于-80 ℃备用。参考文献[2]的方法和条件进行DNA的提取和病毒筛查，阳性样品进一步测序验证，用于定量分析。设计引物（TK-F1/R2）扩增CyHV-2的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因的编码序列，引物序列为5′-ATGGCTTTTCTGGAGTTGGT-3′/5′-CTCTGAGGGTTCGGGAGTGA-3′。PCR扩增程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。目的片段大小为563 bp，并将扩增产物连接到pGEMT-Easy载体上，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.2.2 荧光定量PCR建立 靶向于TK基因，设计扩增引物TK-F2/R2，序列为5′-GCAGAATCCTACAGGGCAGTGT-3′/5′-CTCTGAGGGTTCGGGAG
TGA-3′，扩增目的片段大小为90 bp。PCR反应体系包含10 μL SYBR Premix，TK-F2/R2各 0.5 μL，1 μg组织DNA，加无菌三蒸水至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，50 ℃退火25 s，72 ℃延伸20 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。熔解曲线分析采用仪器默认程序：95 ℃变性5 s，65 ℃退火1 min，温度由65 ℃上升到97 ℃。
1.2.3 人工感染试验 取适量患造血器官坏死症的异育银鲫中肾组织，加入0.01 mol/L PBS溶液（pH 7.4）后充分匀浆， 4℃、5 000 r/min 离心10 min后收集上清，并用0.45 μm的滤器过滤，以构建的荧光定量PCR检测滤出液中病毒的拷贝数。健康异育银鲫购自武汉市某无CyHV-2发病史的养殖基地，体重（100±20） g，试验鱼暂养两周后用于人工感染试验，设置试验组和对照组，各50尾，试验周期7 d。试验组每尾鱼腹腔注射含有108拷贝数的组织匀浆上清100 μL，取发病鱼的脾和中肾组织用于荧光定量PCR分析和组织切片制作，定量扩增在Rotor-Gene Q Series定量仪上完成，组织切片成像在ZEISS Imager.A2显微镜上完成。
2 结果与分析
2.1 TK基因序列分析
收集公共数据库GenBank中关于CyHV-2的TK基因序列并进行比对，结果（图1）表明，SY-C1编码的TK基因与ST-J1分离株除了3’存在9个碱基的缺失外，其他序列均一致。为使得建立的荧光定量PCR可分析不同来源的CyHV-2，本研究中荧光定量PCR引物的位置设计在缺失区域之前。
2.2 荧光定量PCR的建立
选取102～1011拷贝数梯度的TK基因进行荧光定量PCR扩增，以重组质粒拷贝数的对数为x轴、CT值为y轴，构建标准曲线（y=-2.554 1x+34.487），相关系数为0.999 8，扩增效率为1.47。其中1011和102浓度梯度对应的CT值分别为6.59和30.02。结果表明，建立的荧光定量PCR在102～1011范围内呈较好的线性关系（图2）。
2.3 自然感染CyHV-2的金鱼和鲫的病毒载量分析
通过荧光定量PCR扩增，32个阳性金鱼样品中绝大多数的CyHV-2病毒载量为102～105拷贝数/μg DNA（图3）。仅检测到3例高病毒拷贝的金鱼样品，其中福州检测到2例，分别是2.85×108拷贝数/μg DNA和8.32×107拷贝数/μg DNA；广州检测到1例拷贝数为5.25×106的金鱼样品。
11个阳性鲫样品的CyHV-2病毒载量为102～105拷贝数/μg DNA，仅有1例来自滇池的样品病毒含量在105拷贝数/μg DNA以上。自然感染的鱼体携带CyHV-2的载量多低于105拷贝数/μg DNA。
2.4 人工感染CyHV-2的病毒载量分析
由图3可以看出，人工感染CyHV-2的异育银鲫从感染后第三天开始死亡，第四天和第五天达到死亡高峰，荧光定量PCR检测到鳃、脾脏和中肾组织的病毒含量在72 h内迅速增殖到108拷贝数/μg DNA，第五天濒死鱼的脾脏和中肾的病毒拷贝数高达1010拷贝数/μg DNA，对照组没有检测到病毒。
2.5 组织病理学分析
人工感染CyHV-2后第五天，发病鱼体表皮下有点状出血症状，胸鳍和腹鳍基部充血。解剖发现病鱼鳃苍白，有腹水，肝苍白，中肾点状出血现象严重。与健康鱼相比，发病鱼的组织质地脆弱、易碎。自然感染的金鱼和鲫均无明显的临床病状，解剖也未发现明显的病变。组织病理学分析结果表明，人工感染CyHV-2的鱼体脾脏内有大量的点状坏死灶（图4a、图4b）；中肾组织的肾间质细胞和肾小管上皮细胞病变极为严重，间质细胞的核变大，染色质边集的现象普遍，肾小管上皮细胞代谢性质转变甚至急性坏死，肾小球水肿（图4c、图4d）。自然感染CyHV-2的金鱼脾脏网状细胞的细胞嗜性转变，中肾主要表现为炎症。
3 小结与讨论
病毒编码的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因同核酸代谢相关，与病毒的毒力相关[16]，常作为分子检测的靶标。2009年Kurita等[17]和2013年Dong等[18]先后用CyHV-3的TK基因与其他基因作为CyHV-3分型的依据。序列分析表明，不同来源的CyHV-2编码的TK基因存在差异，也可用作分型的依据。本研究首次运用TK基因作为CyHV-2全基因组的等价物检测感染CyHV-2的鱼体组织的病毒拷贝数，其准确定量的范围为102～1011拷贝数，设计的引物避开变异区域，可检测不同来源的CyHV-2。
利用建立的荧光定量PCR分析了43份CyHV-2阳性样品，其中32份为城市的金鱼样品，11份为湖区的鲫样品。荧光定量PCR分析表明，阳性样品的病毒载量为102～105拷贝数/μg DNA。福州地区自然感染CyHV-2的阳性金鱼样品的病毒拷贝数达到了人工感染条件下可致死的病毒拷贝数的范围，其他地区也有个别样品的病毒含量接近这个范围。Goodwin等[20]对自然感染条件下不同来源且无临床病状的金鱼研究表明，病毒的拷贝数的波动范围在102～107，与中国流行病学调查结果具有相似性，证明了无临床病状的金鱼或鲫携带CyHV-2病毒能力和携带高拷贝数的鱼体病毒无临床病状存活，造成该现象的原因可能与金鱼频繁市场流通有关。
锦鲤国际贸易和国际锦鲤观赏展示活动是导致CyHV-2在国际范围内广泛传播的重要原因，造成了严重的经济损失，德国、英国和世界动物健康组织均将其列为必报疾病。中国CyHV-2的流行病学调查证实了CyHV-2在中国内地广泛分布，多个国家或地区有CyHV-2病例的报道，共同证明了CyHV-2在世界范围内广泛分布。金鱼国际贸易的繁荣，且OIE还未将CyHV-2纳入检疫名录，给CyHV-2在世界范围内快速散播提供了便利。CyHV-2在国内从南到北广泛分布的局面，对国内乃至全球的金鱼流通市场和国内野生鲫的种质资源举起了警示牌，需要尽快采取措施，重视CyHV-2的检疫。
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