移植自体骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死

【摘要】 目的 探讨心内膜注射导管应用于干细胞移植治疗心肌梗死的可行性。方法 将移植组和观察组分别经导管注射梗死心肌内移植体外扩增的自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和生理盐水,移植前后、6周及3个月超声评价左心功能。结果 MSCs移植数量平均为(3.81±0.09)×107个;左室射血分数正常对照组为(69.3±2.5)%,心肌梗死后降为(34.9±0.9)%,移植后3个月升至(61.9±1.8)%,超声提示室壁运动增强;与观察组相比,移植组左室收缩末压、左室舒张末压及左室压力最大上升/下降速率改善更明显(均为P<0.01)。结论 进行自体骨髓干细胞经冠脉移植治疗冠心病、心肌梗死具有抑制左室重构、改善心脏功能的作用。

【关键词】 骨髓移植;干细胞;心肌梗死,急性

研究表明由于骨髓中的干细胞具有多向分化潜能,特别是骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),取材方便,可体外扩增,无免疫原性及致瘤性,合乎伦理学要求,自体心肌内细胞移植后可以改善心肌梗死后心功能[1～4]。MSCs移植可以采取不同途径,心肌内注射移植定位准确,可以减少细胞丢失,但需采用进口的NOGA标测系统(NOGAsystem,Biosense-Webster)来完成,由于该设备昂贵,需特殊注射导管,国内难以广泛应用。本研究利用临床常见的介入治疗用导管、导丝等,将体外扩增后自体MSCs进行冠状动脉内注射移植,探讨了其可行性、安全性及治疗效果,为今后干细胞心肌再生治疗的临床研究提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2007年8月至2008年5月在本院心内科住院并确诊为AMI的患者20例,男15例,女5例,年龄42～68岁,平均(50.7±4.9)岁。入选患者需满足以下条件:①典型的缺血性胸痛超过30 min,且舌下含化硝酸甘油不能缓解;②心电图出现病理性Q波,血浆中的肌酸磷酸激酶(CK)增高,血管造影显示3条主要冠状动脉分支中至少有1条完全闭塞;③所有患者均给予PTCA治疗,同时给予肝素、抗血小板药物、血管紧张素转换酶抑制剂、他汀类药物以及β受体阻滞剂和阿司匹林进行治疗。随机分成移植组和观察组两组,每组10例。另外选择20例因不典型胸痛通过冠脉造影排除缺血性心脏病的患者作对照,男13例,女7例,年龄42～65岁,平均(55.6±4.3)岁。对照者入选条件:对照组与AMI组进行性别、年龄配对,经病史询问无心血管疾病史,体格检查无阳性体征,胸片、心电图、肝肾功能、生化常规检查无异常者。合并严重心力衰竭、肝功能衰竭、肾功能衰竭、感染性疾病、肿瘤、外周血管病、脑卒中、血液病者予以剔除。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs的分离、纯化及扩增培养 抽取骨髓液40 ml,肝素抗凝,加入等量DMEM-F12培养液稀释,1.077 g/ml的Ficoll分离液密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,加入完全培养基(DMEM-F12+10%胎牛血清+双抗含100U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素),2～3×105/cm2的浓度接种于25 ml塑料培养瓶中,置于37℃,5%CO2和饱和湿度的孵箱中培养。细胞长到80%融合时用0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA消化并按照8×105/cm2的密度接种1-2比例传代。2～3周后于移植当天消化、计数、DAPI标记,标记后的细胞置于4℃冰浴中备用,于1 h内进行移植。

1.2.2 骨髓干细胞移植 均在梗死相关血管经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后进行干细胞移植。移植的骨髓间充质干细胞数为(3.81±0.09)×107个,骨髓单个核细胞数为(2.1±0.2)×107个。采用over the wire 导管将预先准备好的10 ml含肝素细胞悬液分3或4次注入梗死相关动脉。每次移植细胞时间3 min,间隔3 min后进行第2次移植。移植过程中每次扩张球囊3 min,严密监测患者有无胸痛情况、心电图及腔内压力改变。10例移植过程均顺利。

观察组注射等量生理盐水。

1.2.4 血流动力学及心功能评价 心肌梗死前后及移植术中、术后3个月GenHeartEPS电生理记录仪连续记录左心室压力曲线,记录左室收缩末压(LVESP)、舒张末压(LVEDP)、压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)、心率(HR)。心肌梗死术前后、细胞移植后6周及3个月超声测量左室射血分数(LVEF)。

1.3 统计学方法 数据以x±s表示,SPSS 10.0统计软件分析,组间比较采用成组t检验,P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 骨髓MSCs的培养40 ml骨髓液,每瓶平均获得MSCs(6.2±0.11)×105个,扩增3代后可获3.81±0.09×107个细胞,达到移植数量,DAPI标记率为100%。

2.2 cTnI、血流动力学、心功能及心电图检查结果

2.3.1 cTnI变化 与对照组比较,心肌梗死患者移植组cTnI明显增高(5.56±0.54)ng/dl),(P<0.001。移植组和观察组6周时较心肌梗死后降低(0.93±0.02)ng/dl,( 2.34±0.57) ng/dl,P<0.01),3个月时为(1.02±0.45)ng/dl和(2.56±0.59)ng/dl,仍高于基础值。

2.3.2 血流动力学及心功能改变 与对照组比较,心肌梗死后LVESP降低(P<0.05)、LVEDP明显升高(P<0.01)、LV±dp/dtmax显著下降(P<0.01),细胞移植后上述指标均改善;移植后6周及3个月LVEF虽低于正常值但较心肌梗死后明显改善(P<0.05),而观察组变化不明显;二维超声心动图示3个月时室壁运动较梗死后增强,室间隔运动幅度改善更明显,左心室腔内径明显缩小见表1。

2.3.3 心电图变化 复查心电图未见心律失常。

表1

血流动力学及LVEF的变化(x±s)

组别例数LVESP(mmHg)LVEDP(mmHg)LV+dp/dtmax(mmHg/s) LV-dp/dtmax(mmHg/s)LVEF(%)

对照组20117±19-7.7±1.4 3804±241 3689±205 69.3±2.5

观察组10

基值94±151)-3.5±1.22)2321±1252)2693±992)34.9±0.92)

6周107±123)-4.5±2.13)2788±1413)3001±1123)42.9±2.63)

3月111±103)-4.9±2.43)2933±2073)3095±1093)44.4±1.93)

移植组10

基值95±141)-3.6±1.12)2375±2122)2704±782)34.6±0.72)

6周112±133)-6.8±1.24)5)3289±1023)4)3015±2113)4)56.7±0.84)4)

3月115±164)5)-7.2±1.34)5)3754±2314)5)3417±2224)4)61.9±1.84)5)

注:与对照组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与同组心肌梗死基础值比较,3)P<0.05,4)P<0.01;与观察组同期值比较,4)P<0.05,4)P<0.01;LV+dp/dtmax=左室压力最大上升速率;LV-dp/dtmax=左室压力最大下降速率

3 讨论

细胞移植作为一种崭新的生物学疗法,为心肌梗死特别是各种原因所致的晚期心力衰竭的患者带来了一线希望。临床上选择移植途径的主要目的在于减少细胞的丢失,利于细胞的归巢、定居并增殖,进而与宿主心肌细胞整合功能上协调一致。移植主要方法有:①)经皮移植冠状动脉造影术(PTCA)及支架置入术中或术后,经overthewire球囊导管在梗死相关冠状动脉远端注射;②在NOGA心内膜标测系统的导引下经皮心内膜下注射[5～7];③冠脉移植术同时开胸直视下心肌梗死周边区或瘢痕区经心外膜心肌内注射;④外周静脉注射。静脉输注创伤最小,但是由于目前没有促使干细胞对心肌组织特异性靶向趋化的有效方法,这种方法的有效性仅依赖于干细胞在损伤区的归巢的能力,治疗效果需研究证实;心外膜注射适用于心肌梗死必需接受外科手术或同时需要开胸手术的患者;前两种虽均为介入方法,是大多数患者接受细胞移植的方法,梗死相关冠状动脉脉注射虽可以防止移植细胞直接返流至主动脉内,但细胞进入冠状动脉循环后仍有细胞流失;而心内膜注射避免上述3种方法的不足,优点在于移植部位可以准确定位,移植细胞不需长途跋涉更容易直接进入梗死周边区,更利于趋化因子发挥作用,不足之处在于需特殊设备及特殊注射导管,国内难以广泛开展,特别是对于细胞移植治疗多种心脏病的进一步实验研究受到很大限制。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后可导致心肌细胞死亡,而心肌细胞缺乏增殖能力,在心肌损伤发生后不能再生,只能由成纤维细胞填充,最终由瘢痕组织替代,并逐步发生心室重构形成慢性心力衰竭。当前治疗AMI的方法主要有药物溶栓治疗、经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)、冠状动脉旁路移植术(CABG),虽然在一定程度上可以改善患者的症状,但均难以从根本上恢复心肌细胞数量。近年来,随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展,以及对骨髓干细胞(marrow stem cells,MSCs)研究的深入,人们发现MSCs可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞等,而且移植体内后可以改善心功能,从而为AMI的治疗带来了新的希望[1,2]。研究表明骨髓干细胞移植能够治疗心肌梗死,改善急性心肌梗死近期心脏功能及缺血性心脏病发生的远期结果[8～10],自体MSCs移植克服了伦理及免疫排斥等问题,是目前公认的心肌细胞再生治疗理想的种子细胞。

本次研究结果显示,MSCs移植数量平均为(3.81±0.09)×107个;左室射血分数正常对照组为(69.3±2.5)%,心肌梗死组降为(34.9±0.9)%,移植后3个月升至(56.7±0.8)%,超声提示室壁运动增强;与观察组相比,移植组左室收缩末压、左室舒张末压及左室压力最大上升/下降速率改善更明显(均为P<0.01)。复查心电图未见心律失常。表明MSCs移植治疗心肌梗死疗效明显,安全性好。本研究为自体MSCs移植治疗心肌梗死用于临床提供了方法学及其安全性的实验依据,对心肌再生实验研究及冠心病心肌梗死、缺血性心脏病患者接受细胞移植治疗有着重要的实用价值及临床意义。但本研究也存在不足之处,如样本数少,观察时间较短,其远期疗效尚有等于扩大样本、进行更长期观察验证。

参 考 文 献

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