Pyk2、Twist及MMP—7在肝细胞癌中的表达及临床意义

对照：阳性对照为试剂公司提供的强阳性标本切片，磷酸盐缓冲溶液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.3 判定标准 Pyk2蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒；Twist蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色颗粒；MMP-7蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色颗粒。在不知任何背景资料的情形下，由两位病理专家采用双盲法进行阅片。首先依据染色强度打分：无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分（染色需与背景着色相比较）。再将阳性细胞所占的百分比进行打分：无阳性细胞记为0分，阳性细胞所占百分比（1%～25%）记为1分，阳性细胞所占百分比（26%～50%）记为2分，阳性细胞所占百分比（51%～75%）记为3分；阳性细胞所占百分比（76%～100%）记为4分。最后将染色强度与阳性细胞百分比乘积打分，≥4分记为免疫反应阳性，<4分记为免疫反应阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，等级相关检验采用Spearman。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中Pyk2、Twist、MMP-7表達的比较 Pyk2阳性染色主要位于细胞质，细胞核未见明显染色，染色为棕黄色或棕褐色，小片状或弥漫性分布。两者Pyk2阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.001）。Twist蛋白的阳性着色位于细胞质，染色为棕黄色颗粒。两者Twist阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.001）。MMP-7蛋白的阳性着色主要位于细胞质，染色呈棕黄色或棕褐色颗粒。两组MMP-7阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

2.2 Pyk2、Twist和MMP-7蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系 肝癌中Pyk2阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及AFP等均无关（P>0.05）。Pyk2蛋白阳性表达与病理分级、肿瘤分化、血管侵犯及临床TNM分期均有关（P<0.05）。肝癌组织中Twist阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及AFP等均无关（P>0.05）。Twist蛋白阳性表达与病理分级、肿瘤分化、血管侵犯及临床分期均有关（P<0.05）。肝癌组织中MMP-7阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及AFP等均无关（P>0.05）。MMP-7蛋白阳性表达与病理分级、肿瘤分化程度、血管侵犯及临床分期均有关（P<0.05）。Pyk2、Twist及MMP-7共同高表达伴随肝癌组织分化程度降低、病理分级差及血管侵袭。见表2。

2.3 Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌组织中表达的关系 Spearman等级相关分析发现，肝癌组织中Pyk2与Twist蛋白表达呈正相关（r=0.425，P=0.032），Pyk2与MMP-7的表达亦呈正相关（r=0.498，P=0.026）；Twist与MMP-7的表达亦呈正相关（r=0.302，P=0.041）。

3 讨论

Pyk2（proline-rich tyrosine kinase 2）是一种富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶，定位于人第8号染色体 （ 8p21.1），基因全长4.048 kbp，在脑、肠、脾及肾等多种组织中有表达。Pyk2依赖于钙离子浓度的变化而被激活，调控细胞增殖、分化及侵袭[8-10]。Pyk2能诱导乳腺癌细胞发生上皮间质转化，促进腫瘤细胞侵袭和迁移[11]。本研究发现，Pyk2在肝癌组织中高表达，Pyk2在肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁肝组织（P<0.05），提示Pyk2基因与肝癌的发生、发展有关。进一步研究还发现Pyk2阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床分期密切均相关，提示Pyk2能在肝癌细胞分化、侵袭转移过程中发挥重要作用。

Twist是一个新发现的细胞内转录因子，不仅在胚胎形态发生中起关键作用，还参与调控肿瘤细胞增殖分化、侵袭转移等过程[12]。胰腺癌中Twist高表达，并且与肿瘤分期、侵袭转移密切相关[13]。沉默Twist基因后结直肠癌细胞增殖及迁移力显著下降[14]。本研究结果表明，Twist在肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁肝组织（P<0.05）；并且Twist阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床TNM分期均有关（P<0.05），提示Twist在肝癌侵袭转移过程中发挥重要作用。Twist在低分化、中晚期的肝癌中的表达明显增强，进一步支持了Twist参与了肝癌恶性进展，这与车娜等[15]研究报道相一致。相关性分析表明，Pyk2与Twist在肝癌中的表达呈正相关（P<0.05），提示Pyk2与Twist共同参与了肝癌恶性侵袭，推测Pyk2可能通过上调Twist促进了肝癌侵袭及转移。

基质金属蛋白酶-7（MMP-7）是一种胶原蛋白酶，当MMP-7表达上调，细胞间的黏附力下降，促进肿瘤细胞侵袭及转移[16-18]。MMP-7在食管癌及乳腺癌组织中高表达，其表达与临床分期及淋巴结转移均密切相关[19-20]。本研究结果显示，MMP-7在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁肝组织（P<0.05）。MMP-7阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床TNM分期均有关（P<0.05）。以上结果表明MMP-7与肝癌侵袭转移密切相关。本研究还发现Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌组织中异常表达，并且三者密切相关，提示Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌侵袭转移过程中发挥了协同作用。

综上所述，本研究发现肝癌组织中Pyk2、Twist和MMP-7表达均与肿瘤病理分级、临床分期、肿瘤分化程度及血管侵袭密切相关，提示Pyk2、Twist和MMP-7与肝癌的发生发展和侵袭转移有关。因此，联合检测Pyk2、Twist和MMP-7有助于预测肝癌的局部侵袭及转移，同时也可以作为评估肝癌患者预后的新指标。

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（收稿日期：2016-11-16） （本文编辑：程旭然）

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