材料与方法
1.1 材料与试剂
胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa），哈尔 滨商业大学发酵工程实验室保藏；毒死蜱乳油 （50 g/100 mL），浙江新农化工股份有限公司提供；石油醚，天津市富宇精细化工有限公司提供。
1.2 仪器与设备
JPT型分析天平，江苏常州仪器厂产品；DZP- 102型恒温振荡器，中国哈尔滨东联恒温电子技术开发有限公司产品；5100型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；723N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；MLS-3780型高压蒸汽灭菌锅，上海中安医疗机械厂产品；BCN-1360B型超净工作台，苏州顺鑫净化科技有限公司产品。
1.3 培养基
1.3.1 基础培养基[13]（YPD培养基）
葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸馏水配制，于121 ℃条件下灭菌15 min，固体培养基加琼脂20 g/L。
1.3.2 发酵培养基[14]
在基础培养基中加入25 mg/L毒死蜱农药，蒸馏水配制，于121 ℃条件下灭菌15 min，固体培养基加琼脂20 g/L。
1.4 试验方法
1.4.1 菌种活化
在无菌条件下，将保存于固体斜面上的菌种挑取1环划线到基础固体培养基中，于28 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，长出单菌落后挑取单菌落进行镜检，确定其纯度；然后将菌种接种到液体基础培养基中扩大培养，如此活化2～3次，作为后续试验备用菌液。
1.4.2 紫外分光光度法测定有机磷农药的残留量
在发酵培养基中接菌，在其中取发酵液再加入等体积的石油醚，将其放入空气浴振荡器中以转速150 r/min振荡10 min，以石油醚作为参比，在紫外可见分光光度计中测OD293值，并以毒死蜱浓度为横坐标（X）、毒死蜱于波长293 nm处吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线。
1.4.3 有机磷农药降解率的计算
X=■×100%.
式中：X——农药的生物降解率，%；
Cx——接菌处理培养液中农药质量浓度，mg·L-1；
Cck——未接菌对照培养液中农药质量浓度，mg·L-1。
1.4.4 菌株RM-DY21生长与降解曲线的测定
将菌株RM-DY21接种于发酵培养基中，每隔 2 h取样，分别用紫外分光光度法测培养基中的毒死蜱残留量，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制菌株的生长曲线与降解曲线。
1.5 不同培养基成分及含量对菌株降解有机磷农药的影响
1.5.1 不同碳源及其添加量对菌株降解有机磷农药的影响
将发酵培养基中的碳源除去，分别选择20 g/L 葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉、果糖添加到发酵培养基中，按照2.0%接种量接种后于28 ℃，150 r/min的摇床中恒温振荡培养48 h，研究不同碳源对菌株生长及降解有机磷农药的影响。在确定了最适碳源基础上，分别调节最适碳源添加量10，20，30，40，50 g/L，考察其质量浓度对菌株生长和降解有机磷农药的影响，确定最适碳源质量浓度。
1.5.2 不同氮源及其添加量对菌株降解有机磷农药的影响
将发酵培养基中的氮源除去，分别选择20 g/L胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠作为氮源添加到发酵培养基中，提供菌株生长需要唯一氮源。按照2.0%接种量接种后于28 ℃，150 r/min摇床中恒温振荡培养48 h，研究不同氮源对菌株生长及降解有机磷农药的影响。在确定了最佳氮源基础上，分别调节最适氮源浓度为10，15，20，25，30 g/L，考察其浓度对菌株生长和降解有机磷农药的影响，确定最适氮源浓度。
1.6 培养条件优化
1.6.1 初始pH值对菌株生长及有机磷农药降解率的影响
在发酵培养基中，分别调节初始pH值为3，4，5，6，7。按照2%接种量接种后于28 ℃，150 r/min恒温振荡培养箱中培养48 h，通过测定菌体生长量及有机磷农药降解率确定最佳初始pH值。
1.6.2 培养温度对菌株生长及有机磷农药降解率的影响
在发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值，按2.0%接种量接种种子液于液体培养基中，培养温度分别为26，28，30，32，34 ℃，置于转速150 r/min恒温振荡培养箱中培养48 h，通过测定菌体生长量及有机磷农药降解率确定最佳培养温度。
1.6.3 培养时间对菌株生长及有机磷农药降解率的影响
在发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值及最佳培养温度，按2%接种量接种种子液于液体培养基中，以转速150 r/min于恒温振荡培养箱中培养，每隔2 h测定菌株对有机磷农药的降解率，从而确定最佳培养时间。
1.6.4 响应面分析法优化菌株降解有机磷农药的条件
综合单因素试验结果，利用Design Expert 7.0软件进行响应面设计，并对所得数据进行多元回归拟合及方差分析，得到菌株降解有机磷农药最佳条件培养方案。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
毒死蜱紫外分光光度计定量标准曲线见图1。
由图1可知，在0～200 mg/L 范围内有良好的线性关系，回归方程为Y=0.002 18X+0.006 5，相关系数为R2=0.999 11。
2.2 菌株RM-DY21的生长曲线
菌株RM-DY21的生长曲线见图2。
由图2可知，在基础培养基中菌株RM-DY21适应期长、生长缓慢，38 h后生长趋势相对稳定。
2.3 不同碳源和氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响
2.3.1 不同碳源对菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌体生长的影响
在基础液体培养基中，以25 mg/L毒死蜱质量浓度的发酵培养基为基础，选择葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、淀粉6种碳源，质量浓度均为20 g/L，按2%接种量接种于液体培养基中，培养温度28 ℃，置于150 r/min的摇床恒温培养36 h，测其菌体生长量与降解率；再选取最佳碳源分别配制10，15，20，25，30 g/L的发酵培养基，发酵培养并测其菌体生长量与有机磷农药降解率。
不同碳源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图3，不同乳糖添加量对菌株RM- DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图4。
由图3可知，乳糖对菌株生长影响效果最好，麦芽糖、果糖和葡萄糖次之；乳糖对毒死蜱的降解影响效果最佳，麦芽糖次之。认为菌株利用双糖生长较好，易于利用，大都能有效参与酶合成，而对于蔗糖和可溶淀粉利用率低。综合考虑菌株生长与毒死蜱降解的影响效果，选取乳糖为最佳碳源。然后对于乳糖的不同添加量进行优化试验（如图4），得到乳糖添加量为15 g/L时降解率达到最高，菌体生长量也较高，当乳糖添加量继续增大，由于渗透压的升高，抑制了菌落的生长与繁殖，菌体生长量下降。故选15 g/L为乳糖最适添加量。
2.3.2 不同氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响
在基础液体培养基基础上，以25 mg/L毒死蜱质量浓度的发酵培养基为基础，选择酪蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠6种氮源，质量浓度均为20 g/L，按2%接种量接种于液体培养基中，培养温度28 ℃，置于摇床恒温培养36 h，转速为150 r/min，测其菌体生长量与有机磷农药降解率；再选取最佳氮源分别配制10，15，20，25，30 g/L的发酵培养基，发酵培养并测其菌体生长量与有机磷农药降解率。
不同氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图5，不同硫酸铵添加量对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图6。
由图5可知，酪蛋白胨、大豆蛋白胨和硫酸铵对菌体生长的促进作用高于硝酸鈉，而硫酸铵对毒死蜱的降解效果显著高于其他氮源。因此，综合考虑忽略次要指标菌体生长量，选取对毒死蜱降解效果最好的硫酸铵进行优化。由图6可知，硫酸铵为25 g/L时，降解率达到最高值；继续增大添加量使得培养基内环境发生改变，抑制菌体产酶活性，从而影响其对毒死蜱的降解效果。故选择25 g/L作为硫酸铵的最适添加量。
2.4 培养条件对菌体生长及有机磷农药降解率的影响分析
2.4.1 培养时间对菌体生长及有机磷农药降解率的影响
在液体发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值、培养温度。按2.0%接种量接种种子液于液体培养基中，置于摇床恒温培养24，36，48，60，72 h，转速为150 r/min，发酵培养后取样，分别测得菌体生长量与有机磷农药降解率。
不同培养时间对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图7。
由图7可知，随着培养时间的增加，菌体生长量和降解率均逐步提高，可推测该菌株的产酶为同步合成型，即在生长初期菌株便开始产酶，伴随着菌株的生长，产酶量逐渐上升，到达稳定期时产酶停止。
当培养时间到达36 h时，降解率达到最高；随着培养时间的继续增加，降解率基本保持平稳略有降低。因而，36 h为最佳培养时间。
2.4.2 不同初始pH值对菌体生长及有机磷农药降解率的影响
不同初始pH值对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图8。
在液体发酵培养基中，选择初始pH值分别为3，4，5，6，7，按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，培养温度28 ℃，置于摇床恒温培养36 h，转速为150 r/min，发酵培养后取样，分别测得菌体生长量与有机磷农药降解率。
发酵液适宜的pH值环境对菌体生长及产酶条件具有一定的促进作用。由图8可知，在初始pH值为6时菌株生物量达到最高，而菌体降解有机磷农药的最适初始pH值为5，由于优先考虑降解效率，故选初始pH值为5。
2.4.3 培养温度对菌体生长及有机磷农药降解率的影响
在液体发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值，按2%接种量接种种子液于液体培养基中，培养温度分别为26，28，30，32，34 ℃，置于摇床恒温培养36 h，转速为150 r/min，发酵培养后取样，分别测得菌体生长量与有机磷农药降解率。
不同培养温度对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图9。
由图9可知，培养过程中培养温度对于菌体生长的影响并不显著，但对毒死蜱的降解效果具有一定的影响。由于培养温度是影响酶活力的重要指标，从而影响了菌株对有机磷农药的降解率。在30 ℃时菌体的生长与毒死蜱的降解都达到最优值，故选择30 ℃作为最佳培养温度。
2.5 响应面分析优化菌株降解有机磷农药的条件
2.5.1 响应曲面设计及结果分析
根据Box-Behnken原理，综合单因素试验结果，选取3个对菌株降解有机磷农药影响显著的因素，分别为初始pH值（A）、培养时间（B）、培养温度（C）为自变量，以有机磷农药降解率为响应值进行三因素三水平响应曲面设计试验。
响应面试验因素与水平设计见表1，响应面试验设计及结果见表2。
对初始pH值（A）、培养时间（B）、培养温度（C）进行中心组合设计，利用Design Expert 8.0软 件对表2中数据进行多元回归拟合得到二次回归方程为：
降解率（%）= 82.70-1.29A+0.94B+0.97C+
0.37AB-1.21AC+1.79BC-
11.96A2-6.32B2-7.61C2.
按此回归方程建立响应值的方差分析表，对响应值的显著性进行分析来验证回归模型及试验结构的有效性。
响应面二次回归方程方差分析见表3。
该回归方程的相关系数R2=0.998 4，表明回归方程的拟合良好，与试验结果有99.84%的符合度；修正系数为R2adj=0.996 3，说明该模型具有较高的可信度。因此，可用该模型分析预测胶红酵母菌对有机磷农药的降解率。
对二次多项回归模型进行方差分析（见表3）。模型p<0.000 1，模型的F值为480.81，说明该模型显著；其中A，B，C，AC，BC，A2，B2，C2对菌体生长量影响显著；失拟项F值为0.49，表明失拟项对纯误差不显著，说明模型符合实际。各因素中一次项（A，B，C）、二次项（A2，B2，C2）及交互项（AC，BC）的p值均<0.05，说明其对响应值影响显著；模型失拟项p值0.708 2>0.05，从另一方面说明模型具有良好的拟合度。
2.5.2 响应曲面图形分析
由表3可知，初始pH值、培养温度、培养时间均为影响菌株RM-DY21对有机磷农药降解率的主要因素。
不同初始pH值与培养时间对降解率影响的响应曲面与等高线见图10，不同初始pH值与培养温度对降解率影响的响应曲面与等高线见图11，不同培养时间与培养温度对降解率影响的响应曲面与等高线见图12。
等高线密集且越趋向椭圆形表示两因素交互作用显著，反之则表示交互作用不显著。通过等高线图得到最优条件下各试验因子取值，图10和图12等高线越密集且越趋向椭圆形表明两因素交互作用明显，图10中等高线相对较圆说明交互作用不明显，该结果与表3方差分析结果一致。
通过Design Expert 8.0软件优化后得到菌株RM-DY21对有机磷农药降解的最优条件为初始pH值4.94，培养温度30.16 ℃，培养时间36.34 h，预测降解率可达82.81%。按为试验方便可行，将最优条件修正为初始pH值为5，培养温度30 ℃，培养时间36 h。在优化后的培养条件下进行培养，确定模型与试验的相符性，得到实际降解率为83.86%。实际的降解率与回归方程接近，证明模型的可行性。
3 结论
通过单因素试验，选出胶红酵母菌对有机磷农药降解率最佳碳源为乳糖，添加量为15 g/L；最佳氮源为硫酸铵，添加量为25 g/L；培养条件的最佳初始pH值为5，最佳培养温度为30 ℃，最佳培养时间为60 h。在单因素试验的基础上选取培养温度、培养时间和初始pH值为试验因素，以降解率为响应值，通过Box-Behnken的中心组合设计及响应面法对菌株RM-DY21降解有机磷农药发酵条件进行了优化，建立了菌株对有机磷农药降解条件的二次多项式模型，确定最佳条件为初始pH值5，培养温度30 ℃，培养时间36 h，菌株对有机磷农药的降解率为82.81%。经显著性检验证明，此条件下菌株对有机磷农药的降解率为83.86%，与理论值相差1.05%，表明应用响应曲面法优化菌株RM-DY21降解有机磷农药的条件是可行的，证明该模型具有可靠性。为后续菌株产酶研究的相关试验奠定了良好的基础。
参考文献：
段海明，王开运，乔康，等. 两株毒死蜱降解细菌的分离鉴定及其降解特性[J]. 环境科学学报，2009（4）：723-731.
尹芳，张无敌，周肸，等. 新型生物农药残留降解剂研发及其潜在前景展望[J]. 灾害学，2016（3）：157-159，169.
金潇，颜冬云，秦文秀. 有机磷农药的微生物降解技 术[J]. 湖南农业科学， 2011（9）：93-97.
余臣磊，田江，邓松强，等. 一株广谱农药降解放线菌对敌百虫的降解特性研究[J]. 基因组学与应用生物学，2016（6）：1 451-1 457.
Vanhooke J L，Benning M M，Raushel F M，et al. Three-dimensional structure of the zinc-containing phosphotriesterase with the bound substrate analog diethyl 4-methyl benzyl phosphonate[J]. Biochemistry，1996，35：6 020-6 025.
Pinjari A B，Pandey J P，Kamireddy S，et al. Expression and subcellular localization of organophosphate hydrolase in acephate-degrading Pseudomonas sp. strain Ind01 and its use as a potential biocatalyst for elimination of organophosphate insecticides[J]. Lett Appl Microbiol，2013，57（1）：63-8.
林玉锁. 土壤中农药生物修复技术研究[J]. 农业环境科学学报，2007（2）：533-537.
王华，艾涛，温晓芳，等. 土壤中乐果降解菌的筛选及其特性研究[J]. 农业环境科学学报，2006（5）：1 255- 1 259.
陶玉贵，颜世雷，潘军，等. 氧化乐果降解真菌的筛选及其特性研究[J]. 农业环境科学学报，2007（5）：1 744- 1 748.
L Colosio，E Gorsini，W Bareellini，et al. Imrnune parameters in biological monitoring of pesticide exposure current knowledge and perspectives[J]. Toxicol. Lett，1999，108：285-295.
Ramanathan M P，Lalithakumari D. Complete mineralization of methylparathion by Pseudomonas sp. A3[J]. Appl. Biochem. Biotechnol，1999，80（1）：1-12.
王继雯，甄静，谢宝恩，等. 高效降解有机磷农药真菌的分离鉴定及其特性研究[J]. 中国农学通报，2011，27（27）：265-271.
谢凤行，张峰峰，周可，等. 水质净化酵母菌的分离筛选及鉴定[J]. 微生物学报，2015（5）：635-642.
孟庆林，梁金钟，王风青. 果蔬中残留毒死蜱农药降解菌的选育及鑒定[J]. 食品与发酵工业，2016（4）：108-113. ◇
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