摘要：嵊州桃形李果实营养丰富，但成熟于高温季节，采后易受霉菌感染；为了减少霉菌对嵊州桃形李采后的感染，鉴定致病霉菌种类并开展抑菌试验很有必要。本研究从发病的嵊州桃形李果实分离到一株致病霉菌，经形态学和分子生物学鉴定，并用施保功和苯甲·嘧菌酯进行室内抑菌试验，结果发现：分离到的致病菌为橘青霉Penicillium citrinum（TXL03），菌丝有分支且分生孢子串生；该菌株寄主具广谱性，对雪梨、苹果、油桃、樱桃、小番茄、葡萄、芒果、宝石李和香蕉接种后均可致病；施保功和苯甲·嘧菌酯均可有效抑制该菌丝生长和孢子萌发，但施保功的抑制效果更好，更适宜于嵊州桃形李采后霉菌防治。
关键词：桃形李；橘青霉；分離鉴定；抑菌试验
中图分类号：S 482文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）04-407-06
Isolation， Identification and Antibacterial Tests on Penicillium citrinum for Postharvest Shengzhou Plums
ZHAO Ning1， SONG Yuhui2，CHEN Li1， MO Yiwei1*
（1 College of Life Science， Shaoxing University，Shaoxing， Zhejiang312000， China； 2.Shaoxing No1 High School， Shaoxing， Zhejiang312000， China）
Abstract：The renowned Shengzhou plums （Prunus salicina Lindl. var. taoxingli） ripen in the summer， and are high on nutritional value and appealing on eating quality. However， they turn soft rapidly and are prone to deterioration after harvesting in the summer heat. This study attempted to identify the source of microbial infection and determine an effective antibacterial measure to extend the shelf life for the prized fruits. Using the rDNAITS molecular identification and morphology methods， a pathogen was isolated from the samples of diseased fruits. In the lab， the isolate was treated with Sporgon and difenoconazole+azoxystrobin to confirm it to be Penicillium citrinum （TXL03）. The fungus had numerous branches and conidiophores. It could infect a wide variety of fruits， such as pear， apple， nectarine， cherry， tomato， grape， mango， plum， and banana. Either Sporgon or difenoconazole+azoxystrobin could retard the fungal growth. However， Sporgon appeared more effective， and thus， was recommended for treatment of the disease.
Key words： plum； Penicillium citrinum； isolation and identification； antibacterial test
嵊州桃形李Prunus salicina Lindl. var. taoxingli果实心形、汁液丰富酸甜可口，每年7 月中旬成熟，正值产地高温多雨季节，且桃形李果实糖分含量高、营养丰富，易受各种霉菌侵染而加速果实腐烂和霉变。水果采后霉变致病菌众多，如青霉属Penicillium、链格孢菌Alternaria Nees、绿霉菌Penicillium. digitatum、灰葡萄孢霉Botrytis cinerea和木霉Trichoderma spp.等。不同区域的水果致病菌的种类也不同[1-3]。而桃形李采后致病菌的分离与鉴定仅有何莹蓉等对扩展青霉菌株的报道[4]。目前主要使用化学杀菌剂控制果蔬采后病害，但不同的药剂或剂量对病原菌抑制效果不同，需要分离出相应的致病菌，并需要完成相应杀菌剂的室内毒力试验[5]。施保功有效成分是咪鲜胺，主要通过抑制甾醇和麦角甾醇生物合成而导致病原菌死亡，因其广谱、高效、低毒、低残留等特性被广泛应用于多种果实采后保鲜[6]，经施保功处理能显著减少芒果和紫金春甜桔的采后病害的发生，延长保鲜时间[7-8]；而苯甲·醚菌酯则具很好的渗透性及局部内吸活性，持效期长，高效、广谱且低毒，是环境友好型，符合绿色无公害标准，能抑制多种病原真菌生长，其中醚菌酯是线粒体呼吸抑制剂，能通过阻止线粒体上细胞色素b和c1之间的电子传递，导致能量合成受阻。但施保功和苯甲·醚菌酯两种药剂能否用于桃形李采后致病霉菌的防治还未见报道。本研究对桃形李采后致病霉菌进行分离、鉴定并用苯甲·醚菌酯和施保功进行室内毒力试验，以期为桃形李采后病害的防治奠定基础。
1材料与方法
11试验材料
桃形李从嵊州华堂桃形李市场购回后，室温条件下放置5 d，取出现典型霉菌症状的果实为材料。供试药剂：施保功咪鲜胺锰盐50% （Sporgon，德国拜耳），325%苯甲·嘧菌酯[Difenoconazole.azoxystrobin，先正达（中国）投资有限公司]；供试水果为从绍兴市场购买的雪梨、樱桃、圣女果、葡萄、芒果、苹果、油桃、宝石李、香蕉、火龙果、黄瓜、柠檬和哈密瓜用蒸馏水清洗表面2次后，再用75%酒精浸泡2 min，晾干后进行致病性试验。
12病原菌分离、形态学观察及分子鉴定
参考朱迎迎等[9]的方法从出现霉变的果實中分离致病菌。在PDA培养基上从菌落边缘选择菌丝和孢子在显微镜下观察菌丝体形态、孢子形态等特征。利用真菌DNA试剂盒提取基因组DNA，具体参照臧威等[10]的方法进行，从代表菌株的菌丝中提取基因组DNA，并以其为模板进行PCR扩增，其中上游引物为ITS5：F5′GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G3′，下游引物为ITS4：R5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3′ 扩增真菌28S rDNA 的ITS区域（ITS1、58S、ITS2），PCR 扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，36个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，PCR产物约为600 bp。PCR反应体系参照北京天根公司的试剂盒进行，PCR产物经过纯化后，送上海英骏公司测序，获得序列输入GenBank，以Blast程序对数据库中的序列进行比对分析，以基因库内相似度达98%以上为标准进行微生物鉴定。
13病原菌对不同水果感染试验
参考何莹蓉等[4]的刺伤接种法鉴定病原菌对雪梨、樱桃、圣女果、葡萄、芒果、苹果、油桃、宝石李、香蕉、火龙果、黄瓜、柠檬和哈密瓜致病性，每种处理接种5个果实，以接种灭菌蒸馏水为对照，接种后装入保鲜袋内并封口，置于（30±1）℃，相对湿度为85%～90%的人工气候箱内贮藏，第2 d后开始统计果实发病情况，以果实表面明显看到菌斑扩大确定为发病。
14室内毒力测定
参考姚昕等[11]采用生长速率法进行杀菌剂的室内毒力测定，分别将施保功和325 g·L-1苯甲·嘧菌酯稀释成10、20、50、10、25、50、100、200 mg·L-1，药剂各质量浓度配制时均比设计浓度扩大100倍进行配制，待培养基溶化后，用移液管吸取不同质量浓度药液1 mL 置于99 mL PDA中（温度约为 50℃），制得100 mL含药培养基，趁热将其摇匀后倒入灭菌培养皿中，冷却备用；同时用1 mL无菌水加入99 mL PDA 制作的培养基作为对照，处理与对照均重复4次。在超净工作台上无菌操作，将事先已活化好的直径约4 mm的菌丝块分别接种于含药的培养基及对照培养基正中央，每皿1 块菌饼，置于30℃的恒温下培养，待对照组菌落直径长到距离培养皿边缘约1 cm时用十字交叉法测量菌落直径并做好记录，计算各杀菌剂对病菌生长的影响，用菌落直径平均大小表示（cm）。
15两种杀菌剂对孢子萌发效果的影响
孢子萌发试验采用范青生等[12]的96孔平板培养法，分别制备含施保功和苯甲·嘧菌酯0、05、10、50、250、500、1000、2000 mg·L-1的PDA培养液（不含琼脂），在每孔中加入200 μL，以纯PDA培养液设为对照。然后每孔中再加入50 μL、孢子含量为106个·mL-1的青霉菌孢子悬浮液，在30℃恒温箱中培养10 h，在200倍的显微镜下，观察每种处理10个视野范围内的孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子长度的1/2作萌发标准，计算孢子萌发率和抑制率，孢子萌发率/%=（萌发孢子数/总孢子数）×100%
16数据分析
数据采用SPSS160软件进行方差分析，并用Duncan多重比较进行差异显著性分析。
2结果与分析
21病原菌的分离纯化、形态学观察和分子鉴定
新采收的果实表面光滑，色彩鲜红色，还有部分绿色（图1A）。在贮藏过程中发生霉变时，果实表面失去绿色而变黑，并在果柄和果实表面开裂处出现明显病害症状，发生病害后果实表面出现白色或黑色的菌丝（图1B）。通过选取发病部位和健康部位的交接处，进行表面消毒后，将果肉置于PDA培养基上进行培养，从中分离到一种灰色的菌落再进行纯化后培养3 d，菌落直径就达到20～25 cm。菌落为圆形，表面有突起的现象，具有几道同心环纹；质地通常绒状或中心带絮状；分生孢子颜色是蓝绿色，菌丝体白色；在菌落的中部出现分泌形态大小不一的水珠状分泌物，菌落质地均匀，不透明，中央部位的颜色很深，周围的颜色呈白色（图1C）。在显微镜下对其形态观察发现菌丝有横隔，具分枝状，孢子圆形、不透明、有些连成串珠状结构（图1D）。将孢子悬浮液接种于健康果实，25℃、相对湿度85%条件下，3 d 可见明显的红粉病症状。从病果的典型病斑处进行病菌再次分离，分离到的病菌与接种的病菌一致，符合柯赫氏法则，证明菌株为致病菌，以 PDA培养基或无菌水接种的均未致病。
22病原菌对不同水果的致病性
为了探讨该霉菌对其他不同水果的致病性，分别对雪梨、樱桃、圣女果、葡萄、芒果、苹果、油桃、宝石李、香蕉、火龙果、黄瓜、柠檬和哈密瓜等果实接种后，结果发现雪梨、苹果、油桃、樱桃、小番茄和葡萄在接种后2 d果实表面就出现明显的病斑，且随着时间延长，病斑不断扩大；芒果、宝石李和香蕉要在接种后第4 d才开始出现病斑，而火龙果、黄瓜、柠檬和哈密瓜接种6 d后都没有出现病害症状，说明这几种水果对病原菌不敏感，表明该菌株对寄主既有广谱性，但又具有选择性（图4）。
23不同质量浓度杀菌剂对菌落生长的影响
为了探讨不同的药剂质量浓度处理对菌落生长的影响，分别在加入不同质量浓度施保功和苯甲·嘧菌酯的PDA培养基上培养，6 d后，如图5所示，除了1 mg·L-1和2 mg·L-1的菌落大小与对照相比无显著性差异外（P>005），其他药剂处理后菌落直径均显著低于对照处理（P<005），而且随着药剂质量浓度的增加，对菌落生长的抑制作用更大，当施保功和苯甲·嘧菌酯的使用浓度达50 mg·L-1时，菌落直径分别为对照的1045%和2461%，当药剂的质量浓度达200 mg·L-1时，在培养第4 d没有菌落生长，第 6 d时只在含苯甲·嘧菌酯的培养基开始生长，而施保功培养基上菌落则无法生长。说明高质量浓度施保功和苯甲·嘧菌酯均可显著抑制菌丝生长，且施保功抑菌效果明显优于同剂量的苯甲·嘧菌酯。
24不同药剂对孢子萌发的抑制作用
从图6可知，随着施保功和苯甲·嘧菌酯质量浓度增加，对孢子萌发抑制效果也增强。除了1 mg·L-1与对照无显著差异外（P>005），其他各质量浓度药剂处理对孢子的萌发均有显著的抑制作用（P<005）。如当施保功的质量浓度为50 mg·L-1孢子萌发率仅为对照的756%，当质量浓度达100 mg·L-1时，就已完全抑制孢子萌发。当苯甲·嘧菌酯的质量浓度为50 mg·L-1和100 mg·L-1时，孢子萌发分别为对照的1601%和713%，只有当质量浓度达200 mg·L-1时，孢子萌发率为0。说明高浓度的施保功和苯甲·嘧菌酯均可显著抑制孢子萌发，但相同质量浓度施保功要比苯甲·嘧菌酯对孢子萌发抑制效果更强。
3讨论与结论
31菌株宿主具有广谱性和选择性
在多种病原菌中，青霉菌和链格孢菌均能在较宽的温度范围内生长，在接近零度低温下仍能缓慢生长，属于低温贮藏中也难以控制的病原菌[13]，而且其中的扩展青霉Penicillium expansum不仅能引起果实腐烂还可产生展青霉素，该毒素具有长期的潜在毒性，若过量食用可能致癌或致畸等[14-15]。本研究从桃形李发病果实分离的致病菌株，经过形态和分子生物学鉴定为橘青霉P. citrinum（TXL03）。同时发现该菌株能引起多种水果发生病害，其中雪梨、小番茄、杏、香瓜、葡萄、香蕉、樱桃接种后2 d开始出现致病症状，而苹果、油桃、芒果等要在接种后第4 d才开始出现致病性，而网纹瓜、柠檬、橙子、黄瓜接种6 d后都无病害发生，说明该菌株的寄主既具有广谱性，又具有选择性，这与何莹蓉等[4]从桃形李果实分离得到的扩散青霉菌株P. expansum，（TXL01）结果类似，但两者在寄主要求和致病性速率上却有明显差异，说明桃形李采后贮藏期间容易受不同霉菌的浸染，这与前人在越橘灰霉病病原菌研究结果类似[16]，可能与水果间养分不同或病原菌所需的生长环境差异有关。有研究发现，病害发生与病原菌种类、寄主及其所在环境密切相关[17]，但在本试验中也发现，病害主要发生在果柄与果肉连接部分及有伤口部位，所以在采收和贮运时要避免机械损伤，减少病原菌进入途径，同时在运输及销售时避免与易感病水果的交叉感染。
32施保功和苯甲·嘧菌酯对橘青霉的可能抑菌方式
前人研究表明，相关药剂可通过对致病菌造成氧化伤害、细胞膜破坏、线粒体降解和降低基因表达等方式来抑制菌落的生长[18-19]，如硼酸处理后对冬枣致病菌的线粒体膜及膜电位造成明显破坏，使菌丝生长和孢子萌发受阻[22]。本研究表明，适宜质量浓度的施保功和苯甲·嘧菌酯均能抑制该青霉菌丝生长和孢子萌发，而且相对于菌丝生长来说，孢子萌发对这两种药剂处理更为敏感，但施保功和苯甲·嘧菌酯如何抑制菌株生长和孢子萌发还需要从菌株的细胞结构以及生理生化的影响水平等方面深入研究，才能揭示药剂作用机制。在相同剂量条件下，施保功对菌丝生长和孢子萌发抑制效果要明显强于苯甲·嘧菌酯的处理，利用施保功对桃形李采后霉菌防治可能更为有效，这与利用施保功防治脐橙和芒果霉病结果类似[20-21]。本试验两种药剂试验结果仅是室内的平板试验结果，在桃形李采后实际用量还需进一步研究。因有研究发现，5 mg·L-1施保功就完全能抑制培养基上香蕉炭疽菌的生长，但在香蕉防治效果试验中，质量浓度达200 mg·L-1时，防治效果才达到最好[6]。所以平板抑菌试验的结果仅作为参考，具体药量应以最终防治效果试验为准，同时对其残留量与保鲜时间的关系也需进一步研究[22-23]，在达到防效同时尽量降低药剂用量，提高桃形李食用安全性。
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（责任编辑：林海清）
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