材料与方法
1.1 材料
克氏原螯虾幼虾购自南京高淳县水产养殖公司；试验饲料原料购自南京市水产研究所养殖实验基地。
酸性磷酸酶（ACP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计 试验是在南京晓庄学院生态学省级重点建设学科水产动物生理生态研究室内的18个水族箱中进行的。试验设置6个养殖密度处理组，在相同的水族箱（底面积0.25 m2、水深0.3 m）中分别放养3、5、8、10、13、15尾幼虾[体长（3.5±0.2） cm，体重（2.4±0.2） g]，每个处理组3个重复，对应养殖密度分别为12、20、32、40、52、60尾/m2（表1）。
1.2.2 饲养方法 试验用克氏原螯虾先驯养7 d，待供试虾适应环境、生活正常后，挑选健康状况良好、附肢齐全、大小基本相同的克氏原螯虾称重后随机放入18个水族箱中。各箱随机排列，并放置适量水草、假山石或带孔的砖块供克氏螯原虾躲避和休息。
试验期间及驯养期所用饲料为依据克氏原螯虾幼虾营养需要而制备的硬颗粒配合饲料（粒径为1.2 mm）。配方为：鱼粉5.0%、豆饼35.0%、菜饼5.0%、棉饼5.0%、次粉35.0%、麦麸5.0%、皮糠5.0%、磷酸氢钙1.5%，沸石粉2.0%、盐0.5%、预混料1.0%。试验用水为曝气后的自来水。试验期间水温为室内自然温度（21～28 ℃），全天24 h充气增氧。各处理组分别在每天清晨和傍晚一日两次投喂等量的饲料并做记录，投喂量为每箱虾体重的5%，每周调整一次。每次投喂前1 h吸净前次粪便和残饲后再投喂。每3 d换水1次，每次换水1/3，连续饲养2个月。饲养期结束前1 d禁食，饲养试验结束时对每箱虾计数，对每个个体量体长、称体重，并观察和记录附肢是否完整。计算相对增长率、相对增重率、成活率和附肢完整率等指标。
相对增长率=（终均体长-初均体长）/初均体长×100%
相对增重率=（终均体重-初均体重）/初均体重×100%
成活率=成活尾数/总尾数×100%
附肢完整率=附肢完整尾数/总尾数×100%
1.2.3 测定方法 饲养试验结束后用镊子小心取出各试验组虾的肝胰腺，准确称取部分组织的质量，加9倍生理盐水制成10%的组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取组织匀浆上清液再用生理盐水按1∶9稀释成1%组织匀浆待测。
克氏原鳌虾肝胰腺中ACP、T-SOD、LZM的检测均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。ACP活力采用酚氧化分光光度法测定，其活力单位定义为：每克组织中蛋白质在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1 U（U/g prot）；T-SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定，其活力单位定义为：每毫克组织中蛋白质在每毫升反应液中T-SOD抑制率达50%时对应T-SOD的量为一个酶活力单位（U/mg prot）；LZM活力测定采用空白对照比浊法测定，LZM含量单位为U/mL；具体测定步骤按照说明书进行。各项指标的计算公式如下：
ACP活力=（测定管吸光度/标准管吸光度）×标准管含酚的量（0.003 mg）/组织中蛋白质含量。
T-SOD活力=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度/50%×反应液总体积/取样量/组织中蛋白质含量。
LZM活力=（测定管透光度-空白管透光度）/（标准管透光度-空白管透光度）×标准管浓度（2 000 U/mL）×样本稀释倍数。
1.2.4 统计方法 试验数据用ANOVA进行方差分析，Duncan’s进行多重比较。试验结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 饲养密度对克氏原螯虾生长和成活率的影响
试验结果（表2）表明，饲养密度对克氏原螯虾生长和成活率有显著影响。由表2可见，随着克氏原螯虾饲养密度的增大，平均每尾虾的相对增长率、相对增重率和成活率均呈下降趋势。在饲养密度为12尾/m2和20尾/m2时，相对增长率和相对增重率均较大，2组间没有显著差异，成活率均为100%。当饲养密度达到及超过32尾/m2时，其相对增长率和相对增重率均显著降低，成活率也显著下降。当饲养密度达到及超过52尾/m2时，附肢完整率也显著下降。
2.2 饲养密度对克氏原螯虾肝胰腺三种免疫酶活性的影响
饲养密度对克氏原螯虾肝胰腺ACP、T-SOD和LZM活性的影响见表3。由表3可见，随着克氏原螯虾饲养密度的增大，其肝胰腺ACP、T-SOD、LZM活性均呈下降趋势。在饲养密度为12尾/m2时，3种免疫酶的活性均为最大。当饲养密度达到20尾/m2时，ACP活性开始显著下降，T-SOD和LZM活性虽有下降趋势，但与Ⅰ组（密度12尾/m2组）相比差异不显著；当饲养密度达到及超过32尾/m2时，3种免疫酶的活性均显著降低。
3 讨论
3.1 饲养密度对克氏原螯虾生长和死亡率的影响
本试验结果表明，随着克氏原螯虾饲养密度的增大，其相对生长率（相对增长率、相对增重率）和成活率均显著下降。这与严维辉等[3]对克氏原螯虾成虾的研究结果一致，即随着饲养密度的增大，克氏原螯虾的单位产量、回捕率会下降，收获规格（尾均重）会减小。刘国兴等[4]研究结果表明，高密度养殖会使克氏原螯虾饲料系数、残肢率升高，生长率降低，水质（总氮、总磷、氨氮、亚硝酸盐氮升高）恶化。随着个体的生长及种群密度的增大，引起死亡率增高的原因固然有水体环境质量下降、食物得率降低的原因，但在实验室饲养条件下（如本次试验中，24 h充气增氧、每3 d换水一次、每天按体重的5%投喂）这方面应该不会是主要因素。克氏原螯虾是一种领地意识极强的虾类。严维辉等[5]对克氏原螯虾不同放养密度下残杀情况的试验结果表明，随着饲养密度的升高，克氏原螯虾种群内互相残杀情况越严重，死亡率也就越高，种群增长量则呈下降趋势。就本试验过程中所观察到的实际情况和收获时对存活虾所统计的附肢完整率都真实、准确地证实了这一点。由此可见，克氏原螯虾种群内斗争还表现在对生存空间和领地的争夺，为此种群内不惜互相残杀，而且随着饲养密度的增大其争斗越严重。这应该是克氏原螯虾随着饲养密度的增大其相对生长率和成活率均呈显著下降趋势的重要因素。
3.2 饲养密度对克氏原螯虾肝胰腺三种免疫酶活力的影响
甲壳类动物无特异性免疫系统，以非特异性免疫为主，溶菌酶（LZM）是吞噬细胞杀菌的物质基础，具有机体防御的功能，在动物免疫研究中，溶菌酶活性是衡量动物体非特异性免疫的一个重要指标[6]。酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、淋巴液中的酚氧化酶原系统（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、凝集素等是其机体中重要的免疫因子，以不同的方式抵御病原体的侵袭[7]，SOD是虾体内活性氧防御体系的重要组成部分，LZM、ACP的活性程度可以大体反映机体的免疫机能状况[8]。周俊芳等[9]对凡纳滨对虾的研究表明，集约化养殖模式下的高密度因素对WSSV感染与疾病暴发起促进作用。在本试验中没有对死亡虾体进行疾病的诊断和鉴定，但本试验对各组虾体内的部分免疫酶活力进行了测定。结果表明，随着克氏原螯虾饲养密度的增大，其肝胰腺ACP、T-SOD、LZM活性均呈显著下降趋势，说明随着饲养密度的增大，克氏原螯虾机体的免疫力也在呈显著下降趋势，这可能也是随着饲养密度的增大，克氏原螯虾死亡率逐渐升高、成活率逐渐降低的另一个原因。
3.3 克氏原螯虾适宜的饲养密度
适宜密度应该是既能充分利用水体资源又能避免克氏原螯虾种群内互相残杀现象发生，从而最大限度地发挥其生长潜能、提高其成活率的饲养密度。当然，适宜的饲养密度也应该充分考虑到投放规格的大小。从本试验结果看，克氏原螯虾[体重（2.4±0.2） g]的适宜养殖密度应该为20尾/m2左右。本试验结果表明，饲养密度在这个水平时克氏原螯虾的相对生长率、成活率和机体的免疫水平均较高，与12尾/m2的饲养密度水平差异不显著；而当饲养密度达到32尾/m2及以上时，克氏原螯虾的相对生长率、成活率和机体的免疫水平均显著下降；所以克氏原螯虾[体重（2.4±0.2） g]的适宜养殖密度为20尾/m2左右。养殖实践证明，采用适宜的养殖密度是降低成本、增加效益的有效途径，也是维持渔业水域生态环境平衡和稳定、保持水产养殖业健康和可持续发展的前提条件[10]。
4 小结
在本试验设置的养殖密度梯度范围内，随着密度的增加，克氏原螯虾的相对生长率、成活率、附肢完整率及肝胰腺中的ACP、T-SOD、LZM活性均呈显著下降趋势。考虑到既要能充分利用水体资源又要获得最大的生长率和成活率，综合分析后认为，20尾/m2的饲养密度为此规格克氏原螯虾适宜的饲养密度。
参考文献：
[1] 邓梦颖，吴志强，肖英平，等.养殖密度对克氏原螯虾幼虾生长、摄食和饵料利用影响[J].淡水渔业，2010，40（3）：13-17.
[2] 肖鸣鹤，肖英平，吴志强，等.养殖密度对克氏原螯虾幼虾生长、消化酶活力和生理生化指标的影响[J].水产学报，2012，36（7）：1088-1093.
[3] 严维辉，唐建清，费忠智，等.克氏原螯虾池塘不同放养密度条件下养殖模式化试验[J].江西水产科技，2013（1）：25-26.
[4] 刘国兴，李 玲，彭 刚，等.放养密度对克氏原螯虾生长和养殖水质的影响[J].江西农业学报，2014，26（4）：86-89.
[5] 严维辉，唐建清，史克荣，等.不同放养密度下龙虾残杀情况的试验性研究[J].齐鲁渔业，2008，25（8）：28-29.
[6] 王天神，周 鑫，赵朝阳，等.不同温度条件下克氏原螯虾免疫酶活性变化[J].江苏农业科学，2012，40（12）：239-241.
[7] 许巧情，马念念，赵朝阳，等.三种中草药对克氏原螯虾抗菌活性的影响[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2011，30（6）：507-510.
[8] 郭伟荣，刘利平，张宗锋，等.感染鳗弧菌对花鲈非特异性免疫功能的影响[J].上海海洋大学学报，2011，20（1）：89-95.
[9] 周俊芳，杨先乐，万夕和，等.凡纳滨对虾感染与暴发白斑综合征（WSD）的密度因素分析[J].吉林农业大学学报，2011，33（1）：79-83.
[10] 吴 伟，范立民.水产养殖环境的污染及其控制对策[J].中国农业科技导报，2014，16（2）：26-34.
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