儿童重症肺炎链球菌肺炎的感染状况、耐药性及血清型研究

总结笔者所在医院不同时期儿童重症肺炎链球菌肺炎的感染状况、细菌血清型，并分析其对抗菌药物的耐药性，为儿童重症肺炎链球菌肺炎得到有效预防和治疗，并减少多重耐藥菌株的产生提供有力依据，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2013年6月-2018年6月在笔者所在医院PICU住院治疗的469例儿童重症肺炎患者为研究对象，所有患者均符合小儿重症肺炎的诊断标准[1]。其中男320例，女149例，0～1岁339例，1～3岁93例，3～7岁34例，7岁以上3例。所有菌株均为连续分离的非重复株，同一患儿只取其第一次分离的菌株。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和送检 所有重症肺炎患儿的痰（或肺泡灌洗液）标本均在患儿入住PICU并确诊为重症肺炎时采集。痰液标本采集前均给予清洁口腔后诱导吸痰，肺泡灌洗液的取材均为经消毒过的纤维支气管镜在无菌操作下取得，所有标本均装入无菌痰标本杯内中密封送检。

1.2.2 菌株的分离培养和鉴定 将采集的标本分别接种于哥伦比亚血琼脂平板、嗜血巧克力平板和麦康凯平板上，放于35 ℃、5% CO2培养箱培养。对可疑肺炎链球菌菌落采用手工法奥普托欣试验或质谱仪MALDI-TOF Biotyper（德国bruker公司）进行细菌鉴定。具体操作流程按照《全国临床检验操作规程》执行。

1.2.3 药敏试验 肺炎链球菌采用Kirby-Bauer（K-B）法纸片扩散法对青霉素、头孢曲松、万古霉素、四环素、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星和复方新诺明等抗菌药物（英国OXOID公司产品）进行体外药敏试验，药敏平板选用M-H血琼脂平板（温州市康泰生物科技有限公司产品），操作和结果判读依据美国临床实验室标准委员会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）每年更新的抗菌药物敏感性标准。

1.2.4 血清学分型 采用多重PCR对SP血清型进行检测，将冻存的SP菌种复苏转至哥伦比亚血平板（广州迪景），置35 ℃、5% CO2温箱培养24 h，获得新鲜SP菌落。按以下步骤进行检测：（1）引物设计。参照文献[2]对PCR引物，包括SP荚膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9V、14、18、19A、19F、23F特异性引物，由Invitrogen公司合成。（2）DNA提取和PCR扩增。将新鲜纯SP菌落刮入1 ml生理盐水，按Axygen细菌基因组DNA小量提取试剂盒（柱提取法）步骤提取模板DNA。PCR反应体系为ExTaqDNA聚合酶0.1 μl，10×ExTaq buffer 2 μl，模板DNA 2 μl，dNTPs 1.6 μl，9种混合引物（每种引物200 μm）

0.75 μl，重蒸水补足至20 μl。循环参数：94 ℃ 15 min，94 ℃

30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶电泳成像系统观察产物条带。（3）DNA测序。在紫外灯下切割有条带的胶块，按DNA纯化试剂盒说明书对DNA 进行纯化后，按TA载体试剂盒说明书与pMD18-T载体进行连接，平板克隆。完成后送华大基因公司测序，测序结果经Blast检索与GenBank数据库进行同源性比较分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，将所有数据录入SPSS 22.0内，对其采用频数分析法进行数据的统计与分析。

2 结果

2.1 肺炎链球菌检出情况

469例患儿共采集标本1 185份，阳性标本273份，细菌检出率为23.04%（273/1 185）;其中72份标本为肺泡灌洗液，

1 113份标本为痰液;少数标本查出混合菌感染，最终共培养出298株病原菌。其中前五位细菌分别为：肺炎链球菌（86/298，占28.86%）、流感嗜血杆菌（71/298，占23.83%）、金黃色葡萄球菌（39/298，占13.09%）、肺炎克雷伯菌（22/298，占7.38%）、大肠埃希菌（20/298，占6.71%）。其他细菌数量相对较少，分别为鲍曼不动杆菌（15/298，占5.03%）、铜绿假单胞菌（10/298，占3.36%）、卡他布拉汉氏菌（7/298，占2.35%）、阴沟肠杆菌（5/298，占1.68%）、洋葱伯克霍尔德氏菌（5/298，占1.68%）、肠杆菌科（4/298，占1.34%）、产气肠杆菌（3/298，占1.01%）;医院不动杆菌、产酸克雷伯菌均只有2株（占0.67%）;而阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌、粘金黄杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、脑膜炎败血性黄杆菌、解尿氨酸克雷伯菌、粪肠球菌均仅有1株

（占0.34%）。

2.2 抗菌药物耐药性检测结果

肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明均有较高的耐药性，且呈逐年上升趋势;多数肺炎链球菌对青霉素类、头孢类药物敏感，对万古霉素、利奈唑胺的耐药率为0，未发现对喹诺酮类药物耐药，见表1。

2.3 血清学分型结果

86株临床分离的肺炎链球菌中，检出19F最多，占29.07%（25株），其次为23F，占15.12%（13株），6型占15.12%（13株），19A型占11.63%（10株），其他为：15B型占4.65%（4株），14型占2.33%（2株），15A、18型、9V、4型各占1.16%（1株），另外检出两种血清型混合感染占11.63%（10株），未检出相关血清型5.81%（5株）。

3 讨论

肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是人类最早认识的革兰阳性双球菌，人群对其普遍易感，全球儿童肺炎链球菌的感染率及感染相关病死率高。据报道，据世界卫生组织（WHO）估计，2008年全球5岁以下儿童死亡约880万例，5%死于肺炎链球菌性疾病（pneumococcal diseases，PD）[3];2010年WHO估计全球全年5岁以下肺炎链球菌肺炎患儿共258.50万例，占全球5岁以下肺炎患儿的18.30%，儿童肺炎链球菌肺炎现况不容乐观。

本研究发现笔者所在医院儿童重症肺炎以肺炎链球菌感染为首，与陆芸芸等[4]报道的重症肺炎患儿细菌检出以流感嗜血杆菌为首不同，与刘霞等[5]报道的重症肺炎患儿细菌检出以肺炎克雷伯菌为首亦不相同，也不完全等同于De Schutter等[6]报道的肺炎以流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌为主要细菌病原，提示不同地域、不同病情，肺炎病原菌普可发生不同的变迁。准确掌握本地区重症肺炎病原菌普的变迁情况，可指导临床医生选择有效抗生素，有助于提高重症肺炎的抢救成

功率。

通过本研究发现，肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明等药物耐药性较高，与李立群等[7]报道一致，也可能与大环内酯类药物不合理使用有关。多数肺炎链球菌对青霉素类、头孢类药物还是比较敏感的，笔者尚未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药的菌株，与国内其他报道类似[8]。但国外Sanaei等[9]报道肺炎链球菌对万古霉素的耐药率为1.5%。总的来说，肺炎链球菌的耐药菌率是呈上升趋势的，临床工作中应予以重视。

现实中肺炎链球菌存在90多种血清型，具有强大的致病力和定植力，决定血清型特异性的是其细胞外包绕的荚膜多糖，也是最重要的毒力因子和致病关键，可作为宿主抗体的作用靶点，这也是疫苗应用的基础。肺炎链球菌的血清型与其致病性、耐药性和疫苗有效性等均密切相关，是防治种肺炎链球菌相关性疾病（pneumococcal disease，PD）相关研究的核心。多项研究显示肺炎链球菌多重耐药菌在全球广泛流行，亚洲国家最显著，我国则高达80%～90%[10]。本研究发现，笔者所在医院肺炎链球菌感染引起的儿童重症肺炎，血清学分型以19F为主，这与陈巧君等[11]报道较为类似，也与欧美发达国家广泛应用PCV疫苗之前的结果及亚洲多个国家监测结果相似[12]，但与王启等[13]有关报道略有不同，与李晓等[14]有关报道亦有不同;Xue等[15]对中国儿童171株侵袭性肺炎链球菌菌株采用传统方法检测血清型结果显示以19 F、14、19A、未检出型、6、23F为主，与本文亦略有差异，这说明肺炎链球菌的血清型分布存在地区差异，具有区域性。可能与各地区人群的组成、疫苗的接种情况不同有关。

SP的血清型分布流行特点具有地域、年龄差别，并随时间、环境变迁、人群流动、抗菌素压力、细菌进化和重组等多种因素出现不同时期流行血清型的飘移[16]，因此，持续监测SP的血清型流行分布及改变特征，与研究SP的致病机制、耐药性传播、血清型置换等实验和临床研究都息息相关，对防治PD具有重要的流行病学意义。

综上所述，肺炎链球菌仍是本地区儿童重症肺炎的主要病原菌，血清型分类以19F为主，肺炎链球菌临床耐药问题值得大家关注，应提高肺炎链球菌的鉴定能力，及早发现，正确合理使用抗生素，有效提高儿童重症肺炎的救治成功率。

参考文献

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