[摘要] 目的 观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响，探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制。 方法 荧光显微镜观察透骨草提取物对SMMC-7721细胞形态的影响；免疫组化法检测透骨草提取物对SMMC-7721细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。 结果 荧光显微镜可见，40.91 μg/mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞，细胞皱缩，细胞核固缩，呈新月状且边集，呈现凋亡现象。免疫组化结果显示40.91 μg/mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞Bcl-2蛋白表达明显低于对照组（P < 0.05），而Bax蛋白表达明显高于对照组（P < 0.05）。 结论 透骨草提取物可能通过下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达诱导SMMC-7721细胞凋亡。
[关键词] 透骨草提取物；SMMC-7721细胞；凋亡；Bcl-2；Bax
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）01（c）-0010-03
肝癌发展迅速，恶性程度高，我国每年肝癌患者死亡约13万人，是三大致命癌症之一。因此，防治肝癌是我国医疗卫生事业刻不容缓的任务之一。肝癌的传统治疗疗效均不理想。肿瘤的发生可能与细胞凋亡有关，利用药物诱导肿瘤细胞凋亡称为肿瘤学治疗研究的热点之一。透骨草（Phryma leptostachya L. var. asiatica Hara）具有清热解表、活血消肿的作用[1]。本实验观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞形态以及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，进一步探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制，旨在为透骨草抗肝癌作用的研究和临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药品、试剂及仪器
透骨草乙醇提取物为大连大学中药研究所提供；人肝癌SMMC-7721细胞购自吉林省肿瘤研究所；鼠抗人Bcl-2抗体和鼠抗人Bax抗体购自Cell Signaling Technology公司，通用型SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司；RPMI- 1640培养基购自美国Gibco公司；BB16UV型CO2培养箱为德国Heraeus公司产品；荧光显微镜（CX41）为日本 Olympus公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和分组 SMMC-7721细胞培养于10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃ 5%CO2培养。胰酶消化传代，选用对数生长期细胞。实验组加入透骨草提取物溶液，终浓度为40.91 μg/mL，对照组加入RPMI-1640培养液，继续培养24 h。
1.2.2 荧光显微镜观察SMMC-7721细胞形态 收集的细胞用PBS缓冲液洗2次，1 000 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液（PBS）调整细胞浓度为1×1010/L。取1×1010/L细胞悬液95 μL，加入0.1 g/L吖啶橙5 μL（吖啶橙终浓度为5 μg/mL），37℃孵箱中避光染色10 min。滴加染色后的细胞悬液10 μL与载玻片上，封片，荧光显微镜观察细胞形态。
1.2.3 免疫组化法检测SMMC-7721细胞Bcl-2和Bax蛋白表达 按试剂盒说明进行操作。收集实验组和对照组的SMMC-7721细胞，涂片，固定。3%H2O2室温孵育15 min。与正常山羊血清室温孵育15 min。分别与鼠抗人Bcl-2抗体、鼠抗人Bax抗体37℃孵育2 h，PBS洗3次。与生物素标记二抗室温孵育15 min，PBS洗3次。与ABC液室温孵育10 min，PBS洗3次。DAB溶液显色，蒸馏水冲洗，封片，显微镜下观察计数200个细胞，细胞核和细胞浆出现棕色判断为阳性细胞，无棕色染色者为阴性细胞，计算阳性细胞占所有细胞的比例。
1.3 统计学方法
用SPSS 11.5统计软件对免疫组化检测的Bcl-2和Bax蛋白平均光密度进行方差分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光显微镜观察结果
对照组SMMC-7721细胞形态比较规则，胞核较大且染色均匀。实验组SMMC-7721细胞皱缩，细胞核固缩，呈新月状且边集，呈现凋亡现象。见图1。
2.2 免疫组化染色结果
与对照组相比，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞，细胞核和浆呈现棕黄色的细胞数量明显减少，Bcl-2蛋白表达明显降低（P < 0.05），见图2、表1；与对照组相比，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞，细胞核和浆呈现棕黄色的细胞数量明显增加，Bax蛋白表达明显增高（P < 0.05），见图3、表1。
3 讨论
笔者前期的研究报道透骨草提取物对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用[2]。本实验通过吖啶橙染色方法，首次从形态学角度证实透骨草提取物可诱导SMMC-7721细胞凋亡。
药物抗肿瘤作用机制多与药物诱导肿瘤细胞凋亡密切相关[3]。文献报道，Bcl-2基因具有抑制细胞凋亡的作用[4-6]，而Bax基因具有促进细胞凋亡的作用[7-9]。Bax基因具有和Bcl-2高度同源的BH1和BH2区域，该结构域使Bcl-2和Bax两类蛋白质形成同型或异型二聚体，在细胞增殖与细胞凋亡的过程中发挥重要作用。Bax/Bcl-2比值决定细胞是增殖还是凋亡，Bcl-2增加时，Bax/Bc-2比值下降，Bcl-2同源二聚体升高，促进细胞增殖；而Bax增加，Bax/Bcl-2比值增高，Bax同源二聚体升高，促进细胞凋亡[10-13]。Bcl-2可抑制Caspase-3激活，从而抑制细胞凋亡。但当Bax与Bcl-2结合成异源二聚体时，使线粒体释放细胞色素C，从而促进细胞凋亡[14]。另外，Bcl-2也是Caspase-3的底物，可被切断而失去抗凋亡的能力，进而促进Bax的表达[15]。
本研究结果表明40.91 μg/mL透骨草提取物可显著下调SMMC-7721细胞Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，说明透骨草提取物能通过通过Bcl-2/Bax蛋白诱导SMMC-7721细胞凋亡，此结果为透骨草抗肝癌作用的研究提供了一定的实验依据。透骨草提取物调控Bcl-2/Bax相关凋亡蛋白的机制尚不清楚，有待进一步深入研究。
[参考文献]
[1] 高松.辽南地区药用植物图鉴[M].北京：科学出版社，2008：196.
[2] 曾常茜，高松，沈阳，等.透骨草提取物对肿瘤细胞体外增殖的影响[J].辽宁中医杂志，2009，36（11）：1952-1954.
[3] Fluhr H，Wenig H，Spratte J，et al. Non-apoptotic Fas-induced regulation of cytokines in undifferentiated and decidualized human endometrial stromal cells depends on caspase-activity [J]. Mol Hum Reprod，2011，17（2）：127-134.
[4] Yu J，Zhou X，He X，et al. Curcumin induces apoptosis involving bax/bcl-2 in human hepatoma SMMC-7721 cells [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（8）：1925-1929.
[5] Zhang ZF，Guo Y，Zhang JB，et al. Induction of apoptosis by chelerythrine chloride through mitochondrial pathway and Bcl-2 family proteins in human hepatoma SMMC-7721 cell [J]. Arch Pharm Res，2011，34（5）：791-800.
[6] Zhang C，Liu L，Yu Y，et al. Antitumor effects of ginsenoside Rg3 on human hepatocellular carcinoma cells [J]. Mol Med Report，2012，5（5）：1295-1298.
[7] Wu YY，Zhu L，Ma XY，et al. The anti-proliferation effect of Aikete injection on hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo [J]. Pharm Biol，2011，49（5）：531-538.
[8] Li XQ，Shao SH，Fu GL，et al. Study on norcantharidin-induced apoptosis in SMMC-7721 cells through mitochondrial pathways [J]. Chin J Integr Med，2010，16（5）：448-452.
[9] Li L，Qi Z，Qian J，et al. Induction of apoptosis in hepatocellular carcinoma Smmc-7721 cells by vitamin K（2） is associated with p53 and independent of the intrinsic apoptotic pathway [J]. Mol Cell Biochem，2010，342（1-2）：125-131.
[10] Lu J，Xu SY，Zhang QG，et al. Bupivacaine induces apoptosis via mitochondria and p38 MAPK dependent pathways [J]. European Journal of pharmacology，2011，657（1）：51-58.
[11] Choi MS，Oh JH，Kim SM，et al. Berberine inhibits p53-dependent cell growth through induction of apoptosis of prostate cancer cells [J]. Int J Oncol，2009，34（5）： 1221-1230.
[12] Han LL，Xie LP，Li LH，et al. Reactive oxygen species production and Bax/Bcl-2 regulation in honokiol-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells [J]. Environ Toxicol Pharmacol，2009，28（1）：97-103.
[13] Wang L，Zhang J，An Y，et al. A study on the thermochemotherapy effect of nanosized As2O3/MZF thermosensitive magnetoliposomes on experimental hepatoma in vitro and in vivo [J]. Nanotechnology，2011， 22（31）：315.
[14] Thomadaki H，Scorilas A. BCL-2 family of apoptosis-related genes： functions and clinical implications in cancer [J]. Crit Rev Clin Lab Sci，2006，43（1）：1-67.
[15] Sabarinathan D，Mahalakshmi P，Vanisree AJ，et al. Naringenin promote apoptosis in cerebrally implanted C6 glioma cells [J]. Mol Cell Bio chem，2010，34（2）：215-222.
（收稿日期：2012-10-25 本文编辑：冯 婕）
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