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+vh"h['"uzȬ{ikجr)ޭz5}9]m=Ӎ}v^6^Z"http://www.qzpfhg.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1材料
1.1.1供试药剂。
95.5%嘧霉胺原药由陕西农心作物科技有限公司提供。嘧霉胺原药预溶解于甲醇，配成10 mg/mL母液，保存于4 ℃冰箱中，使用时稀释成适当浓度。
1.1.2培养基。
菌株分离采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，加蒸馏水至1 000 mL。
敏感性测定采用Chapeland组合培养基[3]：葡萄糖10.0 g，琼脂15.0～20.0 g，K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 5.0 g，（NH4）2SO4 1.0 g，加蒸馏水至1 000 mL。
1.2方法
1.2.1试验菌的采集与培养。
2014年11月至2015 年4月，在徐州周围8个区县草莓主产区调查并采集草莓灰霉病病果，用灭菌的木质牙签轻触病果上灰霉病菌霉层，迅速放入PDA培养基斜面上，带回实验室编号，注明时间地点（表1）。1个病果作为1个菌株，用 PDA分离纯化后，得到93个单孢菌株，转至 PDA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中供抗药性测定使用。
1.2.2草莓灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性测定。
采用菌丝生长速率法[6]，将所有单孢菌株置于制备好的一系列浓度含药培养基上，检测草霉灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性。通过测定比较药剂对各菌株的抑制生长有效中浓度（EC50），确定抗性水平。对嘧霉胺的抗药性水平由纪明山等[3]的敏感基线值（0.091 1 μg/mL）确定：菌株的EC50值小于敏感基线的5倍（0.455 5 μg/mL）为敏感菌株，当菌株的EC50值在敏感基线的5～10倍（0.455 5～0.911 0 μg/mL）为低抗菌株，当菌株的EC50值在敏感基线的10～40倍（0.911 0～3.644 0 μg/mL）为中抗菌株，当菌株的EC50值大于敏感基线的40倍（3.644 0 μg/mL）为高抗菌株。
当PDA 培养基灭菌后温度降到40 ℃左右时，加入各药剂，分别制成含嘧霉胺0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的含药平皿。以不加药的PDA培养基为对照组，每处理3次重复。将待检测的灰霉病菌在 PDA平皿上培养3 d 后，取生长活力一致的直径5 mm 的菌片移至各含药平皿上，在25 ℃恒温培养箱培养3 d，十字交叉法测量菌落直径。应以菌丝净生长直径的差异计算各菌株在不同含药培养基上的菌丝生长抑制百分率。用DPS统计软件进行处理，求出药剂对各菌株的EC50、毒力回归方程以及相关系数，并统计各区县抗性敏感菌株的发生频率。
抗性频率=抗性菌株数/测定菌株数×100%
2结果与分析
2.1徐州市不同区县草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率
由表2可知，徐州市的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性比例较高，占总检测菌株的53.76%。徐州市各区县抗嘧霉胺草莓灰霉病菌株的频率和抗药性水平都存在明显差异。铜山区、贾汪区、新沂市、睢宁县草莓灰霉病菌的抗性频率较高，在60%以上； 贾汪区、睢宁县、铜山区、沛县都出现了不同水平的抗性菌株；泉山区检测到低抗菌株和中抗菌株，抗性频率达40.00%；新沂市、丰县检测到的都是低抗菌株，其抗性频率分别是66.67%、10.00%；邳州未检测到抗性菌株，均为敏感菌株。上述区县抗性频率的差异可能与不同地区的用药历史和用药水平有关。
2.2徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性
由表3可知，徐州市的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性出现分化，抗性菌株比例达53.76%。其中，33株属于低抗菌株，占测定菌株的35.48%；8株属于中抗菌株，占测定菌株的8.60%；9株属于高抗菌株，占测定菌株的9.67%；其他43株敏感菌株占测定菌株的46.24%。抗性菌株JW14抗性水平最高，其EC50 是9.083 2 μg/mL，是最敏感菌株PZ5（EC50为0.061 2 μg/mL）的148倍，说明徐州市草莓灰霉病菌已经对嘧霉胺产生不同水平的抗性，以低抗菌株为主，抗性群体较普遍。
3结论与讨论
自20世纪90年代使用苯并咪唑类多菌灵、二甲酰亚胺类腐霉利以及N-苯基氨基甲酸酯类乙霉威杀菌剂防治灰霉病以来，相继有病原菌对药剂产生抗药性的报道[6]，而种植者通过增加施药次数、加大使用剂量保证生产，迫使高抗菌株成为优势种群。嘧霉胺是1998年之后在我国推广的灰霉病特效药，灰霉病菌对该类药剂的抗药性由单基因控制，因此很容易产生抗药性。近年来国内辽宁省、山东省、北京市等关于灰霉病菌对嘧霉胺等苯胺基嘧啶类杀菌剂产生抗药性的报道很多[4]，导致出现高抗菌株，严重影響田间防治效果。该研究通过对93株灰霉病菌检测结果表明，在徐州草莓主产区，草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性较普遍，抗性菌株的比例高达53.76%，抗性水平以低抗为主，并且有向中高抗水平发展的趋势，其中抗性水平最高的菌株是最敏感菌株抗性水平的148倍。江苏省苏南地区草莓灰霉病菌对嘧霉胺出现抗药性，抗性频率在60%以上[7]，这与该研究结果一致。贾汪区、睢宁县、铜山区、沛县4个区县草莓灰霉病菌对嘧霉胺已经出现高抗菌株，风险较大，值得重视。
综上可见，徐州草莓灰霉病菌已经对嘧霉胺产生了不同水平的抗药性，以低抗菌株为主，且抗性菌株较普遍。为了延长嘧霉胺的使用寿命，避免产生严重抗药性给生产带来重大损失，建议徐州市加强对嘧霉胺田间抗药性的监测工作，根据各地的实际情况，与嘧霉胺无交互抗性的药剂交替，减少每季施药量。
参考文献
[1] 钟灼仔，郑其春，雷忠涌.闽东南沿海草莓灰霉病的发生规律及综合防治技术[J].福建农业科技，2010（3）：61-62.
[2] 乔广行，林秀敏，黄金宝，等.8种杀菌剂对番茄灰霉病菌多重抗药性菌株生物活性测定[J].农药，2013，52（1）：57-59.
[3] 纪明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性[J].植物保护学报，2003，30（4）：397-400.
[4] 赵晓军，任璐，周建波，等.山西省蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J].植物保护，2012，38（5）：120-123.
[5] 刘圣明，车志平，陈根强.河南省番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J].农药，2014，53（6）：442-444.
[6] 李兴红，乔广行，黄金宝，等.北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J].植物保护，2012，38（4）：141-143.
[7] 潘以楼，朱桂梅，郭建.江苏草莓灰霉病菌对5种杀菌剂的抗药性[J].江苏农业学报，2013，29（2）：299-304.
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