摘要：以产酶活性与产酶稳定性为指标评价3种固定化细胞产壳聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）方法，以酶比活力、酶结合效率、酶活力回收率及稳定性评价4种固定化壳聚糖酶方法，以筛选最优固定化方案应用于壳聚糖酶的生产。结果表明，海藻酸钠壳聚糖包埋法固定化细胞的产壳聚糖酶活性较高且稳定性好；海藻酸钠壳聚糖吸附包埋固定化壳聚糖酶的酶比活力、酶结合效率与酶活力回收率均为最高，且稳定性强。
关键词：固定化技术；壳聚糖；壳聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）；海藻酸钠
中图分类号：Q556+.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5282-03
Application of Immobilization Technique in Producing Chitosanase
YUAN Jian-ping，HOU Xiao-qiang
（College of Life Science， Langfang Normal University， Langfang 065000，Hebei， China）
Abstract： Chitosanase production was optimized through evaluating three methods of cells immobilization using the activity and stability of enzyme production as indicators. Four methods of enzyme immobilization were evaluated using of the enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability as indicators. The results showed that the sodium alginate and chitosan embed method was the optimal method of cells and enzyme immobilization due to its best performance in the activity and stability of enzyme production and in the enzyme activity， enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability.
Key words： immobilization technique； chitosan； chitosanase（EC3.2.1.99）； sodium alginate
壳聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）是一种高效、专一水解壳聚糖制备壳寡糖的酶[1，2]。近年来，利用专一性壳聚糖酶水解壳聚糖制取壳寡糖已成为甲壳素工业的研究热点与前沿[3，4]。目前壳聚糖酶研究多集中于菌种筛选与游离细胞产酶条件等方面。固定化细胞与固定化酶技术对于提高酶的生产与应用效率有重要意义[5，6]。本试验采用多种方法对产壳聚糖酶菌种及壳聚糖酶固定化进行研究，旨在筛选最适固定化细胞及固定化酶的方法。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
壳聚糖 （脱乙酰度≥80%，济南海得贝海洋生物工程公司），海藻酸钠（黏度范围：1.05～1.15，天津市永大化学试剂开发中心），乙酸、NaOH、甲醇、戊二醛、HCl、NaCl、CaCl2等试剂均为国产分析纯。
1.2 菌种与培养基
产壳聚糖酶菌株Yg，廊坊师范学院生命科学学院微生物实验室保存提供。改良PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖30 g，蛋白胨2 g，KH2PO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，维生素B1 10 mg，蒸馏水1 000 mL，115 ℃高压灭菌30 min[7]。产酶培养基：KCl 5 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 5 g，K2HPO4 0.75 g，FeSO4 0.01 g， 蛋白胨8.5 g， 牛肉膏0.25 g，壳聚糖 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5～8.0，121 ℃高压灭菌30 min[8]。
1.3 方法
1.3.1 固定化细胞产壳聚糖酶 将Yg菌株于改良PDA斜面上活化2次，而后接种于改良PDA液体培养基，36 ℃、180 r/min培养16 h，再用0.75%无菌生理盐水5 000 r/min离心洗涤2次，每次20 min，取菌体沉淀4 ℃保藏备用。采用3种方法对细胞进行固定化处理：①海藻酸钠包埋法。取2.5%海藻酸钠溶液50 mL，加入2 g湿菌体，搅拌混匀，用8号针头从离液面10 cm高处将其滴入2% CaCl2溶液中，滤出凝胶小球，重新置于2% CaCl2溶液中，4 ℃静置硬化2 h[9]。②海藻酸钠壳聚糖包埋法。2.5%海藻酸钠溶液中加入1%的壳聚糖，配制海藻酸钠壳聚糖胶体溶液。取该溶液50 mL，加入2 g湿菌体，搅拌混匀，用8号针头从离液面10 cm高处将其滴入2% CaCl2溶液中，滤出凝胶小球，重新置于2% CaCl2溶液中，4 ℃静置硬化2 h[10]。③壳聚糖吸附法。将2.5%壳聚糖胶体溶液用8号针头滴入凝结液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得到中空壳聚糖球，取出用去离子水洗涤，而后放入Yg菌悬液中，吸附2 h，取出壳聚糖球并用0.75%无菌生理盐水洗涤后备用[11]。
将各试验组固定化菌体小球放入改良PDA液体培养基中，36 ℃、120 r/min 预培养12 h，而后放入产酶培养基中，30 ℃、120 r/min 培养24 h。过滤取滤液于5 ℃、5 000 r/min离心15 min，取上清液即为粗酶液并测定其酶比活力。将产酶后的小球过滤回收，去离子水洗涤后再次产酶，观察固定化细胞的重复利用性能[12，13]。
1.3.2 壳聚糖酶的固定化 取上试验中所得壳聚糖酶粗酶液，利用4种方法分别对其进行固定化处理：①壳聚糖吸附法。3%的壳聚糖胶体溶液，用8号针头将其滴入凝结液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得中空壳聚糖球，取出后用去离子水洗涤3次，吸水纸吸干。加入壳聚糖酶液至刚好没过球，吸附3 h，取出后去离子水洗涤，收集剩余酶液及洗液并测定其体积，称量壳聚糖球质量[14]。②壳聚糖交联后吸附法。按①法制备壳聚糖球，而后将其加入1%戊二醛溶液中，室温交联6 h，去离子水洗涤、吸干。壳聚糖酶吸附方法同①[14]。③酶先交联后壳聚糖吸附法。按①法制备壳聚糖球，取5 mL壳聚糖酶液与0.1 mL 1%戊二醛溶液混匀，作用1 h后加入壳聚糖球，溶液没过球即可，3 h后取出，用去离子水洗涤，收集剩余酶液及洗液并测定其体积，称量该壳聚糖球质量[15]。④海藻酸钠壳聚糖吸附包埋法。取含5%海藻酸钠、2%壳聚糖的海藻酸钠-壳聚糖胶体溶液5 mL与等量的壳聚糖酶液混匀，用8号针头从离液面10 cm处将其滴加到2%CaCl2溶液中。滤出凝胶小球，重新置于2% CaCl2溶液中4 ℃静置硬化2 h，滤出凝胶小球用去离子水洗涤，收集前后CaCl2溶液及洗液并测定其体积，称量该凝胶小球质量[14]。
测定各试验组固定化壳聚糖酶的酶比活力，计算酶结合效率及酶活力回收率。过滤回收初次反应后固定化酶小球，去离子水洗涤后重复反应，观察固定化壳聚糖酶回收及重复利用效率。
1.4 酶活力测定及计算方法
壳聚糖酶活力测定：将酶液与3%壳聚糖溶液分别预热至45 ℃，取5 mL酶液加入50 mL 3%壳聚糖溶液中，混匀并于45 ℃、180 r/min条件下作用，定时取出反应液，加1 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，沸水浴15 min终止反应，离心取沉淀于105 ℃烘干至恒重，称量并计算酶活。酶活力单位定义：每1 min降解1 μg不溶性的壳聚糖为可溶性壳聚糖所需的酶量定义为一个酶活力单位[8]。
洗液中壳聚糖酶活力测定方法同上；固定化壳聚糖酶活力测定时，以固定化壳聚糖酶取代酶液，其余方法同上。
壳聚糖酶液酶比活力=每毫升壳聚糖酶液中所含有的酶活力单位数（U/mL）
固定化壳聚糖酶酶比活力=每克干燥的固定化壳聚糖酶中所含有的酶活力单位数（U/g）[16]
酶结合效率=（原酶液总活力-未固定酶活力）/原酶液总活力×100%[16]。其中原酶液总活力为用于固定化的粗酶液中壳聚糖酶的活力总和，未固定酶活力为固定化处理后剩余酶液及洗液中壳聚糖酶活力总和。
酶活力回收率=固定化酶活力/原酶液总活力×100%[16]。其中固定化酶活力为固定化处理后所得固定化壳聚糖酶的活力总和。
2 结果与分析
2.1 不同方法固定化细胞产酶活力及回收利用性能比较
3种方法固定化细胞产酶活力及回收利用性能测定结果见表1。由表1可见，壳聚糖吸附法固定化细胞第一次产酶活力最强， 但是2次产酶活力差异极大，且固定化小球的机械强度差，稳定性也不高，很难再重复利用。海藻酸钠壳聚糖包埋法固定化细胞第一次产酶活力略低于壳聚糖吸附法，2次产酶活性稳定，且固定化小球机械强度很高，菌体泄露少，重复性好。综合比较，选择海藻酸钠壳聚糖包埋法为最优固定化细胞方案。
2.2 不同方法固定化壳聚糖酶性能比较
各种方法所得固定化酶的性能结果见表2。由表2可知，海藻酸钠壳聚糖吸附包埋法所得固定化壳聚糖酶酶比活力、酶结合效率与酶活力回收率均为最高，且重复利用过程中酶活力损失少，固定化酶的机械强度高，稳定性强，为最佳固定方法。
3 小结与讨论
壳聚糖是产壳聚糖酶的诱导物，在固定化细胞过程中加入壳聚糖可明显提高产酶性能，但是单纯应用壳聚糖进行固定化的机械强度差；固定化壳聚糖酶的过程中，壳聚糖吸附法对酶活力影响小，但酶的结合效率较低且重复性差，戊二醛交联则明显影响了壳聚糖酶的活性。综合分析认为，海藻酸钠壳聚糖包埋法为最优固定化细胞产壳聚糖酶方案。海藻酸钠壳聚糖吸附包埋法为固定化壳聚糖酶的最佳方法。
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