材料与方法
1.1 药物与细胞
氯化两面针碱购于中国食品药品检定研究院（批号：21014-200302），纯度>98%;人喉癌Hep-2细胞购于中国科学院上海细胞研究所，于北京市中西医结合医院药剂科实验室液氮中冻存，待传代3～4次细胞处于对数生长期时用于实验研究。
1.2 仪器与试剂
SW-CJ-2F超净工作台（中国吴江市伟峰净化设备有限公司）;MK3型酶联免疫检测仪（Thermo Lab systems）;2406-2型CO2培养箱（美国SHEL-LAB公司）;Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（美国Yeasen公司）;流式细胞仪FACS Calibur（Becton Dickinson公司）。顺铂（江苏豪森药业集团有限公司，批号：170402）;胎牛血清（德国PAA公司，批号：A15108-1479）;1640培养液（HyClone公司，批号：NUL0212）;MTT（美国Sigma公司，批号：M2128）;Transwell小室（美国康宁公司）。
1.3 细胞培养
Hep-2细胞用含10%胎牛血清的1640培养液进行传代，将培养瓶置于5% CO2、37℃培养箱中，每隔2 d用0.3%胰酶进行消化和传代，待细胞生长至对数生长期时用于后续实验。
1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率
将方法“1.3”中对数生长期的Hep-2细胞，按每孔5×103个接种于96孔培养板，每孔200 μL，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，将上清培养液弃掉，然后不同浓度组分别加入5、10、20、40、60、80 μmol/L的氯化两面针碱溶液，每个浓度设置6个复孔，另外设置不加药的细胞对照组。将各培养板继续培养，分别于24、48、72 h后取出一板，每孔加入20 μL MTT溶液（2 mg/mL），再次孵育4 h后弃上清液，加入DMSO 150 μL，遮光条件下振荡10 min使结晶物充分溶解，于酶标仪492 nm处检测吸光度（OD）值，并计算细胞抑制率，绘制曲线。
1.5 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率
取生长至对数生长期的Hep-2细胞，加入培养液进行稀释，使浓度为1×106/mL，于培养箱中培养24 h后加入氯化两面针碱（终浓度分别为10、20、40 μmol/L），阳性对照组加入顺铂（终浓度为20 μmol/L），空白对照组同样加入1640培养液，继续培养48 h，将300 μL的Binding缓冲液加入使细胞悬浮，再加入Annexin V-FITC 5 μL混合均匀，于20℃避光孵育15 min;最后加入PI染色液5 μL，用流式细胞仪检测凋亡率。
1.6 Transwell法检测细胞侵袭能力
预先将Matrigel用DMEM溶液按1∶8的比例稀释后，铺在Transwell培养皿上室的底部，并在37℃下放置6 h。将培养至对数生长期、无血清的1640培养液作用24 h的Hep-2细胞接种于Transwell培养皿的上室，再加入氯化两面针碱（浓度为5、10 μmol/L），并将无血清的1640作为空白对照，继续培养24 h后，将滤膜上层未侵袭的细胞除掉，再将小室置于4%多聚甲醛溶液中15 min使固定，0.5%结晶紫溶液室温下染色20 min，再用PBS缓冲液漂洗3次，用倒置显微镜（放大倍数为100倍）对膜背面随机5个视野内的细胞（N）进行计数，计算平均数值。侵袭抑制率=（1-N实验组/N对照组）×100%。
1.7 Transwell法检测细胞迁移能力
检测Hep-2细胞的迁移能力的实验方法是将Transwell培养皿上室的Matrigel换成基质胶，其他操作同方法“1.6”。
1.8 统计学方法
本研究所用数据采用SPSS 15.0软件整理、统计、分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对Hep-2细胞生长的影响
氯化两面针碱使Hep-2细胞的增殖能力明显下降，这种降低细胞生长的作用具有浓度依赖性。各浓度随着作用时间的延长，Hep-2细胞增殖活性明显降低，各组细胞增殖抑制率与同一时间点细胞对照组比较明显升高（P < 0.05）。见图1。
各组细胞增殖率与同一时间点细胞对照组比较均明显升高（P < 0.05）
2.2 对Hep-2细胞凋亡的影响
不同浓度的氯化两面针碱与Hep-2细胞共同培养后，与细胞对照组比较，细胞凋亡率均明显增高（P < 0.05）。随着氯化两面针碱浓度的增大，细胞凋亡率逐渐增大。与10 μmol/L氯化两面针碱组比较，20、40 μmol/L氯化两面针碱组Hep-2细胞凋亡率逐渐增多，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表1。
2.3 对Hep-2细胞体外侵袭能力的影响
5、10 μmol/L氯化两面针碱组Hep-2细胞侵袭数与细胞对照组比较均显著降低（P < 0.01），提示这两个浓度的氯化两面针碱体外可抑制Hep-2细胞的侵袭能力，该抑制能力随浓度增加而增强，与5 μmol/L氯化两面针碱组比较，10 μmol/L氯化两面针碱组侵袭细胞数显著减少（P < 0.05）。见表2。
2.4 对Hep-2细胞体外迁移能力的影响
5、10 μmol/L的氯化两面针碱组迁移细胞数与细胞对照组比较均显著降低（P < 0.01），浓度越大迁移细胞数越少，提示氯化两面针碱能浓度依赖性地抑制Hep-2细胞的体外迁移，与5 μmol/L氯化两面针碱组比较，10 μmol/L氯化两面针碱组迁移细胞数显著减少（P < 0.01）。见表3。
3 讨论
喉癌是发生于上呼吸道的头颈部恶性肿瘤，93%～99%的病理分型为喉鳞状细胞癌，发生率占世界范围内每年新发恶性肿瘤病例的2.4%[6]。常规治疗喉癌的方法预后并不理想，局部复发和远处转移是头颈部肿瘤影响疗效和生存率的重要原因[7]。所以，既能有效抑制肿瘤生长，又可降低其转移复发能力的新的治疗方法是众多学者极力寻找的。而氯化两面针碱由于具有良好的抗癌作用，已逐渐成为抗癌药物中的热门研究对象。
细胞凋亡是机体自发启动的维持内环境稳定的一种重要调节机制，当凋亡失去控制就会引起细胞无限增殖[8]。肿瘤也称作细胞增殖周期紊乱性疾病，其区别于其他疾病最明显的特征就是细胞不受机体正常调节而无限制地生长和繁殖。研究表明很多中药可通过各种机制诱导肿瘤细胞凋亡从而减少其增殖[9-13]，其已成为抗肿瘤的最佳治疗方式。已有研究表明，氯化两面针碱在体外可通过阻断AKT通路诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡[14]。恶性肿瘤不同于其他疾病的另外一个特征就是能通过淋巴系统或内循环系统侵袭和迁移至其他组织[15]，并在其他组织中继续不断生长，即为肿瘤转移，这种转移性是导致肿瘤复发和治疗失败非常重要的原因[16-17]。
喉癌与细胞凋亡、分化、侵袭和转移等细胞生物学行为密切相关，侵袭和迁移是喉癌易侵犯周围组织的主要原因[18-20]，已有的手术、靶向治疗和放疗等多种方案对于部分喉癌早期的治疗可获得较好的效果，但是晚期患者的临床疗效欠佳，并常因喉癌的复发或转移影响治疗或导致死亡[21-22]。如能有效抑制喉癌生长，并抑制其向周围转移，可极大地提升喉癌的治愈率。
中医药博大精深，用中药制剂辅助治疗癌症已成为趋势[23-25]，氯化两面针碱是一个非常有前景、可防治肿瘤的中药，其抗肿瘤的作用较广泛，体外研究证实其能有效抑制胃癌、鼻咽癌等多种肿瘤的生长[26-27]。本研究将氯化两面针碱作用于人喉癌Hep-2细胞，分别采用MTT法、Transwell法、Annexin V-FITC/PI双染法探讨氯化两面针碱对Hep-2细胞增殖、侵袭和迁移的抑制及诱导凋亡的潜在作用机制。研究結果显示，氯化两面针碱能显著抑制人喉癌Hep-2细胞的生长，并且在5～80 μmol/L的浓度和24～72 h的时间范围内，随着浓度和时间的增加抑制率也逐渐增加。Annexin V-FITC/PI检测发现，氯化两面针碱诱导Hep-2细胞的凋亡率随着浓度的增加而升高。Transwell实验表明，氯化两面针碱浓度越高，Hep-2细胞侵袭和迁移的细胞数也越少，提示其可浓度依赖性地降低Hep-2细胞的侵袭和迁移能力。这与氯化两面针碱可以剂量依赖性地抑制SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力结果是一致的[28]。
综上，氯化两面针碱可通过诱导Hep-2细胞凋亡来抑制其生长，并能减少Hep-2细胞的侵袭和迁移的数量而抑制其转移，这为临床治疗喉癌提供了一定的研究基础，但是氯化两面针碱抑制Hep-2细胞侵袭和迁移的能力是否与时间有关，以及通过何种机制抑制其迁移，尚需进一步实验证实。
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