现代分析技术在霍山石斛研究中的应用

摘 要：该文综述了现代色谱技术、光谱技术和分子标记技术等分析技术在珍稀药用植物-霍山石斛的化学成分、组效研究、物种鉴定和亲缘关系研究中的应用及其最新研究成果。

关键词：霍山石斛；现代分析技术；应用

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）12-17-05

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng），史称霍石斛、又称米心石斛（米斛）属未进化的兰科石斛属植物。其含有多糖类、生物碱类、联苄类、菲类、氨基酸、倍半萜类等[1-2]，具有增强机体免疫力、调节血糖浓度、抑制肿瘤、明目、提高人体抗氧化水平、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老和退热止痛等药理作用[3]。为大别山区特有种，是安徽省霍山县出产的道地药材，是唯一以地名命名的石斛属物种，2007年被国家质检总局定为国家地理标志产品。

霍山石斛记载最早见于清代赵学敏《本草纲目拾遗》，距今有130a（张应昌编缮初刊）至250a以上（赵学敏完成初稿）历史。因现有市场存量过少，不能作为大宗药材购买，因此在1995版、2000版、2005版、2010版的《中华人民共和国药典》的修订中均没有出现。霍山石斛植株矮小，种子细小无胚乳，在自然状态下发芽率极低，自然分布区域狭窄，仅限于大别山区的安徽霍山、金寨、岳西，湖北英山，河南南召等大别山脉系地区，是石斛属唯一分布于长江以北的种[4-6]。在我国兰科石斛属12个极危级物种中就有霍山石斛[6]。1987年，国务院将其列为野生药材二级保护品种。近几十年，霍山石斛市场价格不断攀升，贵比黄金。为保护珍稀濒危药用植物霍山石斛的种质资源，推进中药霍山石斛资源的可持续开发利用，霍山石斛的规模化繁育技术、仿野生栽培技术正在得到不断发展[7-9]，有关霍山石斛的化学成分提取、分离鉴定和药理药效的研究也在深入开展[10-12]。

中药现代化建设的核心是标准化的建立，标准化包括种质资源标准化和质量控制标准化，其中种质资源标准化是前提，质量控制标准化保障，本文将从种质资源和质量控制两个角度，就现代色谱技术、光谱技术和分子标记技术等分析技术在药用植物-霍山石斛的物种鉴定、亲缘关系、化学成分和组效关系研究中的应用综述如下：

1 现代分析技术在霍山石斛的物种鉴定，亲缘关系和遗传稳定性中的应用

随着现代分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已发展了3个阶段，分别是基于酶切技术的酶切片段长度多态性的分子标记技术，基于PCR技术的扩增片段长度多态性的分子标记技术，和基于核苷酸测序技术的单核苷酸差异的分子标记技术，这些技术广泛地应用在物种的鉴定上。由此衍生的分子标记类型多样，功能各异，目前应用到霍山石斛种质资源研究的分子标记技术有rDNA ITS，ISSR，SSR，RAPD，DALP等分子标记技术[13，14]。代表成果如下：

1.1 霍山石斛鉴别 如何有效的区分霍山石斛及其近缘种，是规范霍山石斛市场的必须要解决的问题。分子标记技术能在分子层面，在植株发育的各个阶段，实施有效的检测。

邓辉等[15]对霍山石斛及其同属相似种进行ISSR分子标记比较研究，结果表明，霍山石斛及其相似种在ISSR分子标记指纹图谱上存在着显著而稳定的差异。根据ISSR分子标记指纹图谱所显示的多态性位点差异，能准确鉴别霍山石斛及其相似种和霍山石斛与其它石斛的杂交种。其方法简单、稳定、重现性好，在霍山石斛的分子鉴定研究中有实际的应用价值。刘石泉等[16]利用石斛属植物基因库中rDNAITS序列数据库进行同源性比较，在与霍山石斛差异较大的区段设计出霍山石斛的1对位点特异性鉴别引物，结果发现在退火温度为60℃时，该引物能把霍山石斛的模板从19份石斛属植物中扩增出来，而其他的石斛属植物均为阴性，证明是一种能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别的有效方法。

1.2 霍山石斛分类 霍山石斛分类学地位的认定一直存在争议，不同的分子标记技术可以从不同的角度对霍山石斛和其他种属的遗传关系进行更加合理的判定。

丁小余等[17]探讨霍山石斛与同属近似种：细茎石斛、曲茎石斛、铁皮石斛药材鉴别的形态及DNA分子证据，对霍山石斛及其近似种的药材进行了外部形态和rDNA ITS序列比较。结果霍山石斛及其近似种在rDNA ITS序列上却存在着显著而稳定的差异。霍山石斛与细茎石斛的rDNA ITS序列差异最小绝对遗传距离为15，而与曲茎石斛的差异较大，绝对遗传距离为42。

金国虔等[18]利用AP-PCR方法对4种霍山来源的石斛属植物基因组DNA进行了多态性分析，从75种随机引物中筛选出10种扩增条带清晰、稳定的随机引物，通过PCR扩增共获得250条DNA片段；利用NT-syspc分析软件对不同石斛品种间的平均遗传距离进行了分析，并利用UPGMA聚类分析方法构建它们的亲缘关系聚类图，结果表明4种霍山来源的石斛品种具有较近的亲缘关系，它们之间的平均遗传相似系数为0.63，其中铁皮石斛和铜皮石斛的亲缘关系最近，两者间的遗传相似系数为0.78，它们与串珠石斛的遗传相似系数分别为0.6和0.61，与霍山石斛的遗传相似系数分别为0.63和0.58；但是，相对于形态接近的铜皮石斛，铁皮石斛与霍山石斛的亲缘关系更近，这为霍山石斛物种的分类定位和道地性成因提供了参考依据

1.3 霍山石斛遗传稳定性

大规模的组培快繁技术是拯救和利用霍山石斛资源的有效途径，但不同材料间的遗传变异程度如何，同一材料间的遗传稳定性差异如何，是组培工作必须首先考虑的问题。

邱婧等[19]分别以霍山石斛成熟种子、茎段和愈伤组织为试管苗的初始材料进行继代培养，利用RAPD、ISSR以及DALP 3种分子标记方法对不同继代次数（1～4代）的霍山石斛试管苗进行分析，结果表明：以成熟种子和茎段为材料的继代培养，其试管苗后代在所检测的范围内未探查到变异，具有较高的遗传稳定性.以愈伤组织为材料的继代培养，其试管苗后代从第4代开始，部分引物带型的强弱发生改变。表明以愈伤组织为出发材料的继代培养种内存在一定的变异，但在4代以内仍可稳定遗传。3种继代方式比较之下，以成熟种子和茎段为材料的继代培养是更能稳定遗传的组培快繁方式。刘石泉[20]等研究霍山石斛同一蒴果组培不同生长阶段遗传稳定性方法：利用从20个随机引物筛选的3个稳定性较好的10碱基引物对已继代7～8次的H23种群进行RAPD检测结果：发现不同阶段内遗传相似系数较大，在85.409 3%～98.360 6%，其中在原球茎、萌芽期和一叶期存在的变异比两叶期、开花期要显著，但程度都极其微弱.结论：来自同一蒴果的变异非常小，建立霍山石斛稳定的无性快繁系是切实可行的。这为利用组培技术快繁霍山石斛的遗传稳定性提供了重要理论依据。

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